Конструирование, экспрессия и выделение «растворимой» формы цитохрома Р45017α человека: ее функциональная характеристика^*,**

Аннотация

В целях получения «растворимой» формы мембраносвязанного цитохрома P45017α (CYP17) – ключевого фермента биосинтеза стероидных гормонов – осуществлено гомологичное компьютерное моделирование пространственной структуры гемопротеида и идентифицированы поверхностные гидрофобные аминокислотные остатки, проведена их сайтнаправленная замена, экспрессированы и выделены в высокоочищенном состоянии гидрофилизованные формы CYP17 человека: CYP17dH (CYP17 c удаленной гидрофобной N-концевой аминокислотной последовательностью (Δ²³)) и CYP17mod (CYP17dH с заменой кластера гидрофобных аминокислот в области FG-петли CYP17). Показано, что удаление N-концевой последовательности, ответственной за взаимодействие с мембраной, не приводит к значительному изменению степени ассоциации белка с мембраной. В то же время форма CYP17mod с гидрофилизованной FG-петлей преимущественно локализуется в цитозольной фракции. В настоящей работе впервые сконструирована «растворимая» форма мембраносвязанного CYP17 человека, не связанная с мембраной. Уровень экспрессии СYP17mod составляет 900 нмоль/л культуральной среды. Фермент выделен и очищен до гомогенного состояния без использования детергентов на всех стадиях процедуры выделения и очистки. Показано, что модификация гидрофобных участков в районе FG-петли не приводит к изменению метаболического профиля при гидроксилировании стероидов, характерного для природного CYP17. Кроме того, модификация белка не изменяет сродство фермента к стероидным субстратам. Полученная «растворимая» форма CYP17 человека используется в качестве объекта для кристаллизации.

Текст статьи

Пожалуйста, введите код, чтобы получить PDF файл с полным текстом статьи: