Исследование влияния гуанидингидрохлорида на конформацию и ферментативную активность стрептомицин-аденилилтрансферазы методами кругового дихроизма и флуоресцентной спектроскопии

Аннотация

Исследована равновесная денатурация стрептомицин-аденилилтрансферазы с помощью КД-спектроскопии, эмиссионной флуоресцентной спектроскопии и связывания с гидрофобным красителем 1-анилино-8-нафталенсульфоновой кислотой. С помощью КД-спектроскопии в длинноволновой УФ-области показано, что ~90% молекул белка сохраняют исходную вторичную структуру в присутствии 0,5 M гуанидингидрохлорида (GdnHCl). С учетом зависимости средних значений эллиптичности остатков при 222 нм и ферментативной активности стрептомицин-аденилилтрансферазы от концентрации GdnHCl установлено, что в 0,75 и 1,5 M GdnHCl белок теряет 50–75% элементов вторичной структуры и 35–60% активности соответственно. В 6 М GdnHCl стрептомицин-аденилилтрансфераза теряет вторичную структуру и активность. Снижение интенсивности флуоресценции и сдвиг λ_max на 5 нм в сторону длинных волн в ответ на повышение концентрации GdnHCl от 0,5 до 6 М указывают на постепенное разворачивание стрептомицин-аденилилтрансферазы. Обнаружено, что в денатурированном белке в отличие от нативного снижаются способность к связыванию 1-анилино-8-нафталенсульфоновой кислоты (ANS) и красный сдвиг λ_max (~5 нм), что указывает на частичное разрушение поверхностных гидрофобных участков молекулы белка при денатурации. Отмечено, что разрушение дисульфидных связей в белке приводит к значительному снижению поверхностной гидрофобности, т.е. поверхностные гидрофобные участки поддерживаются за счет дисульфидных связей даже в денатурированном GdnHCl состоянии. Показано, что в результате тушения собственной флуоресценции триптофана стрептомицин-аденилилтрансферазы акриламидом и йодидом калия в нативном белке большинство остатков триптофана контактируют с растворителем, причем ∼20% из них находятся в окружении отрицательно заряженных групп.

Текст статьи

Пожалуйста, введите код, чтобы получить PDF файл с полным текстом статьи: