3'–5'-экзонуклеазная активность апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы 1 человека по отношению к ДНК, содержащим dNMP и их модифицированные аналоги на 3'-конце одноцепочечного разрыва

Аннотация

Апуриновая/апиримидиновая (АР-) эндонуклеаза 1 человека (АРЕ1) участвует в эксцизионной репарации оснований (ЭРО) ДНК, гидролизуя ДНК с 5′-стороны от АР-сайта. Этот фермент кроме эндонуклеазной обладает другими менее выраженными активностями, в том числе 3’–5′-экзонуклеазной, которая проявляется более эффективно на неправильно спаренных («неканонических») нуклеотидах, поэтому ей приписывают роль корректора синтеза ДНК, катализируемого ДНК-полимеразой β, в процессе эксцизионной репарации оснований. Изучена эффективность 3’–5′-экзонуклеазной активности АРЕ1 по отношению к остаткам dCMP, dTMP и модифицированным фотоактивным аналогам dCMP на 3′-конце одноцепочечного разрыва в ДНК. Включение фотореакционноспособных остатков dNMP в 3′-конец одноцепочечного разрыва, которое проводили c помощью ДНК-полимеразы β с использованием фотоактивных аналогов dNTP. Определена зависимость эффективности экзонуклеазной активности от «каноничности» пары, которую формирует 3′-концевой dNMP, от природы 5′-концевой группы в одноцепочечном разрыве и от условий реакции. Установлены оптимальные условия реакции 3’–5′-экзонуклеазного гидролиза, катализируемого АРE1 in vitro, а также выбраны условия, в которых фотоактивные остатки не отщепляются АРЕ1. Таким образом, эти условия пригодны для использования фотоактивных аналогов dNMP, встроенных в 3′-конец одноцепочечного разрыва ДНК, для фотоаффинной модификации белков в реконструированных системах и клеточных/ядерных экстрактах. Рекомендовано использование фотоаффинной модификации в АРЕ1-содержащих системах FAPdCTP, так как остаток FAPdCMP наименее подвержен экзонуклеазному выщеплению, катализируемому АРЕ1, и не рекомендовано применение FABOdCТP.

Текст статьи

Пожалуйста, введите код, чтобы получить PDF файл с полным текстом статьи: