Биохимическая характеристика рекомбинантной легкой цепи энтеропептидазы человека^*,**

Аннотация

Синтетический ген, кодирующий легкую цепь энтеропептидазы человека (L-HEP), был клонирован в плазмиду рЕТ-32а вслед за геном тиоредоксина после последовательности ДНК, кодирующей сайт узнавания энтеропептидазы. Слитный белок тиоредоксин/L-HEP был экспрессирован в штамме Escherichia coli BL21(DE3). Автокаталитическое расщепление и активация рекомбинантной легкой цепи энтеропептидазы человека (L-HEP) были достигнуты после растворения телец включения и ренатурации слитного белка Trx/L-HEP. Проведен сравнительный анализ кинетических параметров энтеропептидаз человека и быка при различных концентрациях ионов Ca²⁺ и Na⁺ для расщепления как специфического субстрата GD₄K-na, так и неспецифических субстратов, таких как тиоэфир Z-Lys-SBzl и хромогенные субстраты Z-Ala-X-Arg-pNA. Показано, что положительно заряженные ионы увеличивают константу Михаэлиса (K_m) L-HEP при расщеплении специфического субстрата GD₄K-na, в то время как каталитическая константа (k_cat) практически не меняется. Была обнаружена вторичная специфичность L-HEP по отношению к хромогенному субстрату Z-Ala-Phe-Arg-pNa c k_cat/K_m 260 мM^–1 · с^–1. Ферментативная активность L-HEP подавлялась ингибиторами трипсинподобных и цистеиновых (E-64), но не амино-, металло- или химотрипсинподобных протеиназ. L-HEP работала в широком диапазоне pH (6−9) с оптимальной активностью при pH 7,5, а также демонстрировала высокую стабильность к различным денатурирующим веществам.

Текст статьи

Пожалуйста, введите код, чтобы получить PDF файл с полным текстом статьи: