Очистка и характеристика внутриклеточной β-глюкозидазы метилотрофных дрожжей Pichia pastoris

Аннотация

Гомогенный препарат β-глюкозидазы Pichia pastoris получен высаливанием сульфатом аммония с последующей гель-фильтрацией и ионообменной хроматографией на Q-Sepharose и СМ-Sepharose. Фермент представляет собой тетрамер (275 кДа), состоящий из четырех идентичных субъединиц (70 кДа). Оптимум pH для него – 7,3, однако он довольно устойчив в диапазоне pH 5,5–9,5. Температурный оптимум этого фермента составляет 40°. Очищенная β-глюкозидаза довольно активна на п-/о-нитрофенил-β-D-глюкопиранозидах (p-/o-NPG) и 4-этилумбеллиферил-β-D-глюкопиранозиде (4-MUG) со значениями K_m 0,12, 0,22, 0,096 мМ и V_max 6,19, 9,95, 11,73 мкмоль · мин^–1 · мг^–1 соответственно. Кроме того, очищенная β-глюкозидаза показала различный уровень активности с п-нитрофенил-1-тио-β-D-глюкопиранозидом, целлобиозой, гентиобиозой, амигдалином, пруназином, салицином и линамарином. Конкурентными ингибиторами фермента в реакции с p-NPG, o-NPG и 4-MUG в качестве субстратов оказались глюконолактон, п-/о-нитрофенил-β-D-фукопиранозиды (p-/о-NPF) и глюкоза. o-NPF оказался самым эффективным ингибитором активности фермента; значения K_i для реакций с p-NPG, o-NPG и 4-MUG составили 0,41, 0,25 и 0,29 мМ соответственно. Показано, что фермент более устойчив к ингибированию глюкозой; в этом случае значения K_i для реакций с p-NPG и o-NPG составили 7,81 и 5,85 мМ соответственно. Для функциональной экспрессии гетерологичных β-глюкозидаз использовали P. pastoris, в связи с чем обсуждается риск получения высокого фона β-глюкозидазной активности.

Текст статьи

Пожалуйста, введите код, чтобы получить PDF файл с полным текстом статьи: