Использование модифицированных флэп-структур для исследования белков системы эксцизионной репарации оснований^*

Аннотация

Для исследования взаимодействия белков, принимающих участие в длиннозаплаточном пути эксцизионной репарации оснований, были сконструированы ДНК-дуплексы со свисающей одноцепочечной частью, в которых олигонуклеотид, формирующий флэп, содержал модификации в сахарофосфатном остове. Если флэпформирующий олигонуклеотид состоял из двух нуклеотидных последовательностей, соединенных декандиоловым линкером, находящимся в точке перехода одноцепочечного участка в ДНК-дуплекс, наблюдалось изменение эффективности и позиции расщепления такой структуры флэпэндонуклеазой-1 по сравнению с субстратами, сформированными на основе природных олигонуклеотидов. Скорость расщепления химерной структуры флэпэндонуклеазой несколько ниже, чем природной ДНК. При введении второй модификации во флэпформирующий олигонуклеотид эффективность расщепления снижается еще более резко. Чтобы оценить, насколько эффективно химерные флэп-субстраты опознаются и процессируются ферментами эксцизионной репарации оснований, были определены скорость синтеза ДНК, катализируемого ДНК-полимеразой β, и скорость выщепления нуклеотида с 3′-конца инициирующего праймера экзонуклеазной функцией АРЕ1 в сравнении с такими же активностями для нативных ДНК-дуплексов. Показано, что эффективность синтеза с вытеснением цепи, катализируемого Pol β, выше для флэп-структур, содержащих ненуклеотидные вставки. Показано, что АРЕ1 проявляет 3′-экзонуклеазную активность на химерных структурах, хотя она ниже, чем на природном субстрате. Таким образом, ДНК-дуплексы с ненуклеотидными вставками могут быть использованы в реконструированных системах, содержащих флэпэндонуклеазу, для имитации интермедиатов длиннозаплаточного пути ЭРО. На основе химерных и природных олигонуклеотидов были созданы фотоактивные ДНК, в которых фотореакционноспособный нуклеотид вводился в 3′-конец инициирующего праймера за счет активности ДНК-полимеразы β. Проведена фотоаффинная модификация белков системы ЭРО с использованием нескольких типов ДНК-структур: ДНК-дуплекса с выступающей матричной цепью, ДНК-дуплекса с разрывом и флэп-структур, в которых флэпформирующий олигонуклеотид был представлен обычной цепью ДНК или содержал ненуклеотидные вставки.

Текст статьи

Пожалуйста, введите код, чтобы получить PDF файл с полным текстом статьи: