Эффект ионов кальция на энтеропептидазный катализ^*

Аннотация

Исследовано влияние ионов кальция на гидролиз низкомолекулярных субстратов различными формами энтеропептидазы. Для тестирования препаратов энтеропептидазы с укороченной тяжелой цепью, лишенных вторичного трипсиногенсвязывающего центра и обладающих низкой активностью к трипсиногену, разработан метод определения активности с помощью тиобензилового эфира N-бензилоксикарбонил-L-лизина (Z-Lys-S-Bzl). Определены кинетические константы гидролиза этого субстрата при рН 8,0 и 25° нативной энтеропептидазой (K_m = 59,6 мкM; k_cat = 6660 мин^–1; k_cat/K_m = 111 мкM^–1 · мин^–1), препаратом энтеропептидазы с делецией фрагмента 118–783 тяжелой цепи (K_m = 176,9 мкM; k_cat = 6694 мин^–1; k_cat/K_m = 37,84 мкM^–1 · мин^–1) и трипсином (K_m = 56,0 мкM; k_cat = 8280 мин^–1; k_cat/K_m = 147,86 мкM^–1 · мин^–1). Показано, что Z-Lys-S-Bzl гидролизуется ферментами с первичным трипсиновым центром с близкой эффективностью. Обнаружено, что ионы кальция в 3 раза активируют гидролиз субстратов типа GD₄K-Х природной полноразмерной энтеропептидазой; на гидролиз субстратов, содержащих один или два остатка Asp/Glu в положениях P2–P3, добавление Ca²⁺ оказывает, напротив, слабое ингибирующее влияние. В случае легкой цепи энтеропептидазы, а также фермента, содержащего укороченную тяжелую цепь (фрагмент 466–800), эффект активации ионами кальция не отмечен ни для одного из исследованных субстратов. Результатами экспериментов по гидролизу синтетических субстратов энтеропептидазы GD₄K-F(NO₂)G, G₅DK-F(NO₂)G (F(NO₂) – остаток п-нитрофенил-L-фенилаланина) и GD₄K-Nfa (Nfa – β-нафтиламид) продемонстрирована возможность регуляции с помощью ионов кальция побочного нежелательного гидролиза при использовании энтеропептидазы (полноразмерного природного фермента) для процессинга химерных белков.

Текст статьи

Пожалуйста, введите код, чтобы получить PDF файл с полным текстом статьи: