Клонирование, очистка и характеристика диаминобутиратацетилтрансферазы из галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z^*

Аннотация

L-2,4-диаминобутиратацетилтрансфераза (ДАБАцТ) катализирует одну из ключевых реакций биосинтеза бактериального осмопротектора эктоина – ацетилирование L-2,4-диаминобутирата (ДАБ) с образованием Nγ-ацетил-2,4-диаминобутирата (ДАБ). Ген ectA, кодирующий ДАБАцТ галотолерантного алкалофильного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z, клонирован и экспрессирован с дополнительными шестью остатками His на С-конце в Escherichia coli. С использованием аффинной металл-хелатной хроматографии получен гомогенный препарат фермента с удельной активностью 200 Е/мг. Показано, что ДАБАцТ является гомодимером и имеет молекулярную массу 40 кДа. Фермент наиболее активен при рН 9,5 и температуре 20°, причем активность возрастает в 3 раза в присутствии 0,1–0,2 М NaCl или 0,2 М KCl. Константы Михаэлиса рекомбинантной ДАБАцТ, определенные при оптимальных значениях рН и температуры в присутствии 0,2 М KCl, составляют 460 и 36,6 мкМ для L-2,4-ДАБ и ацетил-CоА соответственно. Фермент специфичен к L-2,4-ДАБ и ацетил-CоА, а также активен с пропионил-CoA (20%). Ионы Zn²⁺ и Cd²⁺ в концентрации 1 мМ полностью ингибируют рекомбинантный фермент; ATP в концентрации 10 мМ ингибирует активность фермента на 26%; ЭДТА, о-фенантролин, ADP, NAD(P) и NAD(P)H не оказывают заметного влияния на ферментативную активность. Обсуждается возможность участия данного фермента в регуляции биосинтеза эктоина у M. alcaliphilum 20Z.

Текст статьи

Пожалуйста, введите код, чтобы получить PDF файл с полным текстом статьи: