БИОХИМИЯ, 2005, том 70, вып. 8, с. 1041–1050

УДК 577.152.361

Замены остатков глицина Gly100 и Gly147 в консервативных петлях снижают скорости конформационных перестроек неорганической пирофосфатазы Escherichia coli*

© 2005 В.М. Моисеев 1**, Е.В. Родина 1,2, С.А. Курилова 2, Н.Н. Воробьева 1, Т.И. Назарова 2, С.М. Аваева 2

1 Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова

2 НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова

Поступила в редакцию 28.02.2004
После доработки 12.11.2004

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: неорганическая пирофосфатаза, структура, активность, конформационная подвижность, остатки глицина, константа диссоциации.

Аннотация

Неорганическая пирофосфатаза (РРаза) E. coli – однодоменный глобулярный белок, для которого характерны минорные структурные перестройки, затрагивающие подвижные участки полипептидной цепи. Для выяснения возможной роли этих участков в катализе в данной работе были изучены каталитические свойства мутантных РРаз E. coli с заменами Gly100Ala и Gly147Val в консервативных петлях II и III. Основным результатом введенных мутаций явилось резкое снижение скоростей конформационных перестроек, необходимых для связывания активаторных ионов магния, в то время как сродство ферментов к ионам металла не ухудшилось. Определены рН-независимые параметры kcat и kcat/Km гидролиза MgPPi мутантными РРазами. Величина kcat для Gly100Ala и Gly147Val вариантов составляет 4 и 25% от kcat нативного фермента соответственно. Значение kcat/Km для обоих мутантных вариантов снижается на два порядка. Замена Gly147Val на порядок увеличивает рН-независимое значение Km. Изучение синтеза пирофосфата в активном центре мутантных РРаз показало, что максимальный уровень синтезируемого пирофосфата для Gly100Ala в 2 раза, а для Gly147Val варианта в 5 раз выше, чем для нативного фермента. Полученные результаты свидетельствуют, что подвижность петель, в которых расположены остатки Gly100 и Gly147, необходима на стадиях связывания субстрата и ухода продуктов. Для РРазы Gly100Ala наблюдается также сильное ухудшение сродства PPi к эффекторному центру.

Текст статьи

Пожалуйста, введите код, чтобы получить PDF файл с полным текстом статьи:

captcha

Сноски

* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM04-049, 27.02.2005.

** Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.