БИОХИМИЯ, 2005, том 70, вып. 6, с. 829–837
УДК 577.21:577.151
ДНК-метилтрансфераза FauIA, модифицирующая второй остаток цитозина в непалиндромной последовательности 5'-CCCGC-3' (выделение и свойства)*
1 НПО «Сибэнзим»
2 Научно-исследовательский институт молекулярной биологии и биофизики СО РАМН
Поступила в редакцию 19.05.2004
После доработки 08.09.2004
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: ДНК-метилтрансферазы, системы рестрикции–модификации, ферментативная кинетика, Flavobacterium aquatile.
Аннотация
Ген ДНК-метилтрансферазы FauIA из системы рестрикции–модификации FauI (сайт узнавания 5′-CCCGC-3′) был клонирован в экспрессирующий вектор pJW, который использовался для трансформации клеток E.coli RR1 с последующей термоиндукцией и наработкой биомассы бактериальных клеток. Высокоочищенный препарат ДНК-метилтрансферазы – М.FauIA, был получен с помощью хроматографии на различных носителях. Выделенный фермент имеет молекулярную массу ~39 кДа, что соответствует теоретически установленной молекулярной массе соответствующей рамки трансляции. Изучение свойств полученного фермента показало, что М.FauIA имеет температурный оптимум 33° и проявляет максимальную активность при pH 7,5. Метилированием ферментом М.FauIA синтетического олигонуклеотида с последующим расщеплением различными рестриктазами и анализом полученных продуктов установлено, что М.FauIA модифицирует второй остаток цитозина в последовательности 5′-CCCGC-3′. Определены кинетические параметры реакции метилирования синтетического олигонуклеотидного дуплеска ферментом М.FauIA и показано, что константа Михаэлиса (Km) для этого субстрата составляет 0,16 мкМ, Km для S-аденозил-L-метионина (SAM) равно 0,78 мкМ, а значение каталитической константы (kкат) составило 0,05 мин–1.
Текст статьи
Сноски
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Paper in Press, BM04-132, 26.12.2004.
** Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.