Клонирование дуоденазы и ее молекулярное моделирование в аспекте эволюции субстратной специфичности сериновых протеаз, утративших консервативную дисульфидную связь в активном центре^*

Аннотация

Сериновые протеазы млекопитающих, такие как гранзимы, химазы, катепсин G, локализованные в 14-й хромосоме (Homo sapience, Mus musculus), и родственные им ферменты, включая дуоденазу, образуют особую группу внутри семейства химотрипсина, которую здесь мы называем «граназами». Ферменты этой группы утратили древнюю дисульфидную связь в активном центре Cys191–Cys220 (нумерация бычьего химотрипсиногена А), которая строго консервативна в классических сериновых протеазах, таких как протеазы поджелудочной железы, свертывания крови и фибринолиза, а также в гранзимах А, М, К и эластазах лейкоцитов. Мы определили структуру кДНК, кодирующую дуоденазу быка (Bos taurus), – граназу с необычной двойной трипсино- и химотрипсиноподобной специфичностью. В результате секвенирования кДНК был обнаружен 17-членный сигнальный пептид и типичный для граназ активационный дипептид (GlyLys). Образование зрелого фермента, по-видимому, сопровождается дальнейшим протеолитическим процессингом С-концевого пентапептида дуоденазы. Аналогичный С-концевой процессинг известен для другой граназы с двойной специфичностью – катепсина G человека. С помощью филогенетического анализа, в котором были использованы 39 граназ, мы восстановили эволюцию остатков 189 и 226, ключевых для первичной специфичности сериновых протеаз. В ходе анализа было выявлено отсутствие очевидной связи между изменчивостью остатка 189 и появлением новых каталитических свойств у граназ, тогда как изменчивость остатка 226 однозначно приводит к появлению внутри этой группы ферментов подгрупп с разной специфичностью. Обсуждается архитектура протяженного субстратсвязывающего участка граназ и структурная основа двойной специфичности дуоденазы, исходя из данных молекулярно-динамического моделирования. Сделан вывод, что зволюция граназ, для которых как для регуляторных протеаз важна выраженная избирательность, осуществлялась путем тонкой подстройки специфичности на трех уровнях – первичном, вторичном и конформационном.

Текст статьи

Пожалуйста, введите код, чтобы получить PDF файл с полным текстом статьи: