Конструирование протеолитически стабильной NADPH-цитохром P450-редуктазы^*

Аннотация

NADPH-цитохром P450-редуктаза – флавопротеин, взаимодействующий с мембраной N-концевым гидрофобным доменом (аминокислотные (АК) остатки 1–56). Это универсальный донор электронов для всех форм цитохрома Р450, локализованных в мембране эндоплазматического ретикулума. Мембраносвязанный гидрофобный домен Р450-редуктазы легко отщепляется при ограниченном трипсинолизе, а также подвергается спонтанному протеолизу по сайту Lys56–Ile57 бактериальными эндопротеазами при экспрессии и очистке рекомбинантного флавопротеина. Удаление N-концевого гидрофобного фрагмента NADPH-цитохром P450-редуктазы сопровождается потерей ферментом способности передавать электроны на цитохром Р450. В настоящей работе методом сайт-направленного мутагенеза осуществлена замена остатка лизина (Lys56) на Gln и получена устойчивая к спонтанному протеолизу полноразмерная форма белка, обладающая спектральными и каталитическими свойствами Р450-редуктазы дикого типа. Методом ограниченного протеолиза трипсином и протеиназой из Staphylococcus aureus очищенных и мембраносвязанных форм мутанта Lys56Gln Р450-редуктазы и флавопротеида дикого типа определена локализация отдельных АК линкерной области относительно мембраны. На основании результатов изучения линкерной области Р450-редуктазы предложена структурная схема N-концевого фрагмента Р450-редуктазы в мембране. Показано, что N-концевой гидрофобный участок АК (1–46) необходим для взаимодействия Р450-редуктазы с цитохромом Р450.

Текст статьи

Пожалуйста, введите код, чтобы получить PDF файл с полным текстом статьи: