Новые фосфоспецифические антитела для анализа фосфорилирования белковых продуктов генетического локуса киназы легких цепей миозина

Аннотация

В гладких мышцах с генетического локуса гладкомышечной/немышечной киназы легких цепей миозина (КЛЦМ) независимо экспрессируются два основных продукта – КЛЦМ и некиназный белок KRP (телокин), содержащий C-концевую последовательность и основные участки фосфорилирования КЛЦМ in vivo. В то время как КЛЦМ необходима для активации миозина и сокращения, KRP считается антагонистом КЛЦМ и фактором расслабления гладкой мускулатуры, причем внутриклеточные активности КЛЦМ и KRP могут контролироваться фосфорилированием. Мы получили фосфо- и сайт-специфические антитела для избирательного анализа уровня фосфорилирования ключевых остатков КЛЦМ и KRP. С их помощью мы измерили степень фосфорилирования KRP в гладкой мускулатуре до и после повышения внутриклеточной концентрации Ca²⁺, стимуляции аденилатциклазы, протеинкиназы C и митоген-активируемых протеинкиназ (МАР-киназ). Форсколин и форбол-12,13-дибутират повышали уровень фосфорилирования Ser13 KRP в продольной мышце тонкого кишечника (ileum) крысы от 25 до 100%, но не вызывали сокращения. При Ca²⁺-зависимом сокращении, вызванном KCl или карбамоилхолином, уровень фосфорилирования Ser13 KRP не менялся, но увеличивался до максимума при последующей форсколинзависимой релаксации. Эти результаты свидетельствуют в пользу внутриклеточного контроля уровня фосфорилирования Ser13 KRP со стороны нескольких сигнальных путей и его предполагаемой роли в расслаблении гладких мышц. Напротив, уровень фосфорилирования остатка Ser19 KRP изменялся незначительно (от 30 до 40–45%) и только в ответ на активацию МАР-киназ, что свидетельствует против его регуляторной значимости в гладкой мускулатуре.

Текст статьи

Пожалуйста, введите код, чтобы получить PDF файл с полным текстом статьи: