Анализ транспортера серотонина в тромбоцитах человека методом иммуноблоттинга с помощью сайт-специфических антител

Аннотация

Получена панель сайт-специфических антител к различным фрагментам молекулы транспортера серотонина (СЕРТ) человека: 1) моноклональные антитела 23С5 (МкАТ23С5) к С-концевому фрагменту СЕРТ 597–630, 2) поликлональные антитела (ПкАТ) к фрагменту 69–83 в N-концевой части СЕРТ и 3) ПкАТ к фрагменту 86–100 в начале первого трансмембранного домена (ТМД). Для получения антител использовали рекомбинантные белки и синтетические пептиды, включавшие соответствующие участки СЕРТ. Указанные антитела аффинно очищали, конъюгировали с пероксидазой хрена и использовали для анализа СЕРТ методом иммуноблоттинга в экстрактах тромбоцитов человека. Ds-Na-экстракты тромбоцитов приготовляли в условиях, исключающих неспецифическую деградацию белка. Все антитела выявляли в экстрактах тромбоцитов 67-кДа белок, по-видимому, представляющий собой целую молекулу СЕРТ (теоретическая молекулярная масса 70 кДа). Кроме того, были обнаружены иммунореактивные полипептиды меньшего размера (56, 37, 35, 32, 22 и 14 кДа), вероятно N-концевые, С-концевые и неконцевые фрагменты СЕРТ. Преинкубация меченных пероксидазой анти-СЕРТ антител с избытком соответствующего антигена приводила к исчезновению окрашивания белковых полос, что указывает на специфичность окрашивания. Высказано предположение, что СЕРТ подвергается в тромбоцитах программированному протеолитическому расщеплению (процессингу), в результате которого из 70 кДа-белка-предшественника образуется ряд полипептидов меньшего размера. Возможно, один из этих полипептидов – продуктов протеолиза СЕРТ, необходим для осуществления транспорта серотонина. Вероятные сайты специфического протеолиза – область около ТМД 1 и внутриклеточная петля между ТМД 4 и ТМД 5.

Текст статьи

Пожалуйста, введите код, чтобы получить PDF файл с полным текстом статьи: