Экспрессия анионной пероксидазы табака в клетках Escherichia coli и ее рефолдинг из телец включения^*

Аннотация

Кодирующая ДНК гена анионной пероксидазы табака (ТОР) была клонирована в вектор pET40b. Проблема «редких» для прокариот кодонов AGA и AGG (кодируют остаток аргинина) была решена путем использования штамма Escherichia coli BL21(DE3) Codon Plus. Уровень экспрессии апобелка пероксидазы табака в выбранном штамме составил более 40% общего белка. Оптимизация процедуры рефолдинга пероксидазы табака была проведена на основе известной методики рефолдинга рекомбинантной пероксидазы хрена. Выход реактивации рекомбинантной пероксидазы табака составляет ~7%, удельная активность по АБТС – 1100–1200 ед. активности на 1 мг белка. Изучены зависимости скорости окисления АБТС перекисью водорода от концентрации субстратов в отсутствие и в присутствии 50 мМ Ca²⁺. Показано, что данная реакция, катализируемая рекомбинантной негликозилированной ТОР, протекает по механизму типа пинг-понг, причем в присутствии ионов кальция бимолекулярная константа скорости взаимодействия фермента с перекисью водорода уменьшается в 2–2,5 раза, а соответствующая константа для АБТС – в 1,5 раза. Таким образом, ионы кальция оказывают ингибирующее действие на рекомбинантную пероксидазу табака аналогично их действию на нативный фермент. Полученные данные свидетельствуют о том, что олигосахаридная часть молекулы природной пероксидазы табака не влияет на ее кинетические свойства и на взаимодействие с ионами кальция.

Текст статьи

Пожалуйста, введите код, чтобы получить PDF файл с полным текстом статьи: