Активность анионных и катионных трипсинов в интервале 5–37°. Мутантные анионные трипсины как модель низкотемпературных (психрофильных) ферментов

Аннотация

Изучены температурные зависимости кинетических констант (k_cat и K_m) ферментативного гидролиза п-нитроанилидов N-сукцинил-L-аланил-L-аланил-L-пролил-L-аргинина и N-сукцинил-L-аланил-L-аланил-L-пролил-L-лизина катионным трипсином быка и анионным трипсином крысы (дикого типа и мутантными вариантами). Проведено сравнение экспериментальных данных с соответствующими литературными для гидролиза п-нитроанилида N-бензоил-DL-аргинина катионным трипсином быка и природными трипсинами рыб, обитающих при низких температурах. Обнаружено различие в организации S₁-субстрат-связывающего кармана у анионных и катионных форм трипсина. Различный характер связывания остатков лизина и аргинина в этом центре (S₁) проявляется также в противоположном характере температурных зависимостей констант гидролиза соответствующих субстратов анионными и катионными трипсинами. Полученные данные показывают, что сравнивать влияние каких-либо факторов на связывание субстратов (величину K_m) для трипсинов анионного или катионного типа, так же как и на каталитическую активность k_cat, следует только с соответствующими данными для природного фермента того же типа. В качестве приближенных моделей природных психрофильных трипсинов путем сайт-направленного мутагенеза получены мутанты анионного трипсина крысы по остаткам K188 или Y228. Замена заряженного остатка лизина в положении 188 на гидрофобный остаток фенилаланина приводит к сдвигу рН-оптимума соответствующего мутантного трипсина K188F с 8,0 до 9,0–10,0, как в случае некоторых природных психрофильных трипсинов, а также в 1,5 раза повышает его каталитическую эффективность при низких температурах по сравнению с ферментом дикого типа.

Текст статьи

Пожалуйста, введите код, чтобы получить PDF файл с полным текстом статьи: