БИОХИМИЯ, 2003, том 68, вып. 7, с. 985–991

УДК 577.152.3

Адапторный белок Rukl образует в клетках НЕК293 белок-белковые комплексы, обладающие эндонуклеазной активностью

© 2003 Ю.Я. Кит 1, В.Р. Дрель 1, О.И. Петрив 1, В.А. Ковалева 1, Г.Ю. Шуваева 1, Е.Ю. Паливода 1, Е.И. Вовк 1, Я.П. Бобак 1, И. Ржешовска-Вольни 4, И.Т. Гут 3, В.Л. Бухман 2, Л.Б. Дробот 1*

1 Институт биологии клетки Национальной академии наук Украины

2 The University of Edinburgh

3 Ludwig Institute for Cancer Research

4 M. Sklodowska-Curie Memorial Institute, Branch in Gliwice

Поступила в редакцию 26.08.2002

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: адапторные белки, SH3-домен, Rukl, CIN85, SETA, белок-белковые взаимодействия, гепаринсефароза, ДНКазная активность.

Аннотация

Структурно-функциональная организация адапторного белка Rukl характеризуется наличием на N-конце трех SH3-доменов, за которыми локализуются Pro- и Ser-богатые последовательности и С-концевой «coiled-coil»-район. Множественные модули в структуре Rukl, вовлеченные в белок-белковые взаимодействия, могут обеспечивать формирование кластеров лигандов с различными биологическими свойствами и субклеточной локализацией. Для изучения природы и биологической роли таких комплексов рекомбинантный белок Rukl с Glu-эпитопом на С-конце (Rukl Glu-tagged) был очищен из трансфицированных клеток НЕК293 аффинной хроматографией на белок G-сефарозе с ковалентно конъюгированными анти-Glu-tag-антителами. Электрофорезом в Ds-Na-ПААГ с последующим окрашиванием серебром в составе очищенного препарата рекомбинантного белка помимо Rukl Glu-tagged с молекулярной массой 85 кДа был обнаружен ряд минорных полос. Методом задержки электрофоретической подвижности в геле 32P-меченых олигодезоксирибонуклеотидов в составе препарата Rukl Glu-tagged были выявлены белки со сродством к нуклеиновым кислотам. Установлено также, что препарат Rukl Glu-tagged обладал способностью гидролизовать как олигодезоксирибонуклеотиды, так и плазмидную ДНК. При этом ZnCl2 и гепарин ингибировали ДНКазную активность. На основании полученных результатов было сделано предположение, что в клетках НЕК293 присутствуют ДНКазы, ассоциированные с белком Rukl. Для выделения таких комплексов лизаты клеток НЕК293 подвергали хроматографии на колонке с гепаринсефарозой. Элюцией 0,5 и 1 M NaCl были получены две фракции, обладающие ДНКазной активностью и включающие белки с молекулярными массами 83, 80 и 72 кДа. Реакция ингибировалась ZnCl2 и гепарином, а предварительная преципитация белков, родственных Ruk, с помощью анти-Ruk-АТ приводила к истощению нуклеазной активности. Иммуноблоттингом с использованием анти-Ruk-AT в составе фракций был идентифицирован белок с молекулярной массой 83 кДа, иммунологически родственный белку Rukl. Сделан вывод о том, что адапторный белок Rukl образует в клетках HEK293 комплексы с эндонуклеазами.

Текст статьи

Пожалуйста, введите код, чтобы получить PDF файл с полным текстом статьи:

captcha

Сноски

* Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.