Молекулярное клонирование и гетерологическая экспрессия в Escherichia coli цитохрома Р45017α. Сравнение структурных и функциональных свойств субстрат-специфичных цитохромов Р450 различных видов

Аннотация

С целью выяснения природы субстратной специфичности и механизма гидроксилирования стероидов в настоящей работе осуществлены молекулярное клонирование и гетерологическая экспрессия в Escherihia coli кДНК трех новых форм цитохрома Р45017α семейства Bovidae (овца, коза и бизон), который катализирует реакцию 17α-гидроксилирования прогестерона (P4) и прегненолона (P5) и 17,20-лиазную реакцию, приводящую к отщеплению боковой цепи стероидов с образованием C₁₉-стероидов. Рекомбинантные цитохромы Р45017α экспрессированы в E. coli в виде производных, содержащих гистидиновый кластер на С-концевой последовательности, и очищены с помощью металлоаффинной хроматографии. Высокоочищенные препараты цитохромов Р45017α использованы для определения профиля ферментативной активности по отношению к прогестерону, прегненолону, 17α-гидроксипрогестерону (17-P4) и 17α-гидроксипрегненолону (17-P5) с регистрацией кинетики образования продуктов реакции с помощью ВЭЖХ. Показано, что каждая форма цитохрома Р45017α характеризуется своим профилем ферментативной активности и зависимости 17,20-лиазной реакции от присутствия в реакционной среде цитохрома b₅. Анализ ферментативной активности известных форм цитохрома Р45017α с учетом полученных в настоящей работе данных позволяет разделить известные ферменты на три группы: группа А (свинья, хомяк, крыса) – цитохром Р45017α катализирует реакции 17α-гидроксилирования прогестерона и прегненолона и 17,20-лиазную реакцию окисления 17α-гидроксипрогестерона и 17α-гидроксипрегненолона; группа Б (человек, бык, овца, коза, бизон) – цитохромы Р45017α, которые не имеют или имеют незначительную 17,20-лиазную активность по отношению к 17α-гидроксипрогестерону, превращающую последний в андростендион; группа В (морская свинка) – цитохром Р45017α, который либо вообще не имеет, либо имеет незначительную 17,20-лиазную активность по превращению 17α-гидроксипрегненолона в дегидроэпиандростерон.

Текст статьи

Пожалуйста, введите код, чтобы получить PDF файл с полным текстом статьи: