Роль шаперонов Hsp70 (DnaK–DnaJ–GrpE) и Hsp100 (ClpA и ClpB) в рефолдинге и повышенной термостабильности бактериальных люцифераз в клетках Escherichia coli

Аннотация

Исследуется роль шаперонов Hsp70 (DnaK–DnaJ–GrpE) и Hsp100 (ClpA–ClpB –ClpX) в рефолдинге термоинактивированных люцифераз из морских бактерий Photobacterium fischeri и наземных бактерий Photorhabdus luminescens. Эти люциферазы гомологичны, однако значительно различаются по скорости термоинактивации и по константе скорости люминесцентной реакции. Показано, что рефолдинг термоинактивированных люцифераз полностью определяется системой DnaK–DnaJ–GrpE. Однако по скорости и уровню рефолдинга эти люциферазы заметно различаются. Если термолабильная, «быстрая», люцифераза Ph. fischeri в процессе рефолдинга восстанавливает активность до 80% от исходного уровня за несколько минут, то термостабильная, «медленная», люцифераза Ph. luminescens ренатурирует значительно медленнее (десятки минут) и достигает всего лишь ~7–8% от исходного уровня. Измерение скорости термоинактивации люцифераз in vivo в клетках Escherichia coli дикого типа и мутантных по генам clpA, clpB, clpX показало, что люцифераза Ph. luminescens проявляет пониженную термоустойчивость в мутантном штамме E. coli clpA^–. Показано, что этот эффект не связан с DnaK-зависимым рефолдингом. Для термолабильной люциферазы Ph. fischeri влияние мутации в гене clpA на ход кривой термоинактивации практически отсутствует. Предполагается, что денатурированная люцифераза Ph. luminescens имеет повышенное сродство к белку-шаперону ClpA по сравнению с DnaK, в то время как термолабильная люцифераза Ph. fischeri, напротив, имеет повышенное сродство к шаперону DnaK. Связывание денатурированной люциферазы с ClpA защищает ее от агрегации, а последующий рефолдинг, по-видимому, происходит спонтанно и очень быстро (в пределах 1–2 мин). Данный процесс относится к разряду ATP-зависимых, так как введение в бактериальные клетки разобщителя окислительного фосфорилирования карбонил-цианид-3-хлорофенилгидразона приводит к резкому снижению термостабильности люциферазы до уровня, характерного для фермента in vitro. В бактериях E. coli, мутантных по гену clpB, также наблюдается повышенная термочувствительность люцифераз, однако этот эффект определяется DnaK-зависимым рефолдингом и имеет место для обеих люцифераз Ph. fischeri и Ph. luminescens и, по-видимому, связан со способностью шаперона ClpB проводить дезагрегацию белков, подготавливая их к взаимодействию с шаперонами семейства Hsp70 (DnaK–DnaJ–GrpE).

Текст статьи

Пожалуйста, введите код, чтобы получить PDF файл с полным текстом статьи: