Повышение эффективности модификации ДНК-полимераз с использованием бинарной системы фотоаффинных реагентов

Аннотация

Бинарная система фотоаффинных реагентов была предложена ранее для высокоселективного мечения ДНК-полимераз 5′-[³²P]ДНК-праймерами. В настоящей работе показана возможность использования этого подхода для повышения эффективности модификации ДНК-полимераз. Фотоактивную 2,3,5,6-тетрафтор-4-азидобензоильную (FAB) группу встраивали в 3′-конец 5′-[³²P]ДНК-праймера с помощью ДНК-полимераз β или Tte в присутствии одного из аналогов dTTP − FAB-4-dUTP, FAB-4-ddUTP или FAB-9-dUTP. Полученную реакционную смесь облучали светом с длиной волны 334–365 нм (прямое мечение) либо 365–450 нм в присутствии сенсибилизатора – одного из аналогов dTTP, содержащих остаток пирена (Pyr-6-dUTP или Pyr-8-dUTP). При использовании бинарной системы фотоаффинных реагентов FAB-группа активируется светом только в составе комплекса реагент−ДНК-полимераза−Pyr-6(8)-dUTP посредством переноса энергии от сенсибилизатора, локализованного в dNTP-связывающем центре ДНК-полимеразы. Прямая активация FAB-группы в данных условиях незначительна. Наибольшая эффективность фотопришивки наблюдается при использовании в качестве фотореагента ДНК-праймера, несущего на 3′-конце остаток FAB-4-dUMP, и в качестве сенсибилизатора − Pyr-6-dUTP. Показано, что в условиях 10-кратного избытка праймера по отношению к ферменту такая бинарная система фотоаффинных реагентов позволяет достичь 60%-ного уровня мечения ДНК-полимеразы β, что в ~2 раза выше уровня прямого мечения, обеспечиваемого в более жестких условиях (334–365 нм).

Текст статьи

Пожалуйста, введите код, чтобы получить PDF файл с полным текстом статьи: