Биотрансформация стероидов рекомбинантными дрожжами, экспрессирующими цитохром P-45017α

Аннотация

кДНК, кодирующая цитохром P-45017α из коры надпочечников быка, экспрессирована в Saccharomyces cerevisiae под контролем индуцируемого галактозой GAL10 промотора. Разностные карбонильные спектры дрожжевых клеток, индуцированных галактозой, свидетельствовали об уровне экспрессии цитохрома P-45017α до 240 нмоль на 1 л культуры. Связывание прогестерона с цитохромом P-45017α четко фиксировалось на интактных дрожжевых клетках, что проявлялось в регистрации разностных субстратных спектров поглощения типа I. Дрожжевые клетки, растущие на минимальной среде, содержащей галактозу, активно превращали прогестерон в 17α-гидроксипрогестерон, что свидетельствовало о функциональном сопряжении гетерологично экспрессированного цитохрома P-45017α и его эффективном взаимодействии с конститутивной NADPH-цитохром P-450 редуктазой. Более чем 80% метаболита секретировалось в культуральную среду. Культивирование на богатой неселективной среде сопровождалось образованием дополнительного продукта, который был идентифицирован масс-спектрометрией как 17α-гидрокси-20-дигидропрогестерон. Кинетический анализ позволил установить, что его образование следует за цитохром P-45017α-зависимой реакцией гидроксилирования. Восстановление 20-кетогруппы 17α-гидроксипрогестерона происходило также с неиндуцированной культурой дрожжей, что свидетельствовало об участии в этом процессе конститутивного фермента. Среди различных использованных субстратов, прогестерон гидроксилировался экспрессированным цитохромом P-45017α с наивысшей активностью, затем 11β- > 11α- > 19-гидроксипрогестерон. Полученные результаты свидетельствуют, что использованная система хозяин–вектор приемлема для функциональной экспрессии цитохрома P-45017α и использования энзиматических свойств этого цитохрома Р-450 для проведения специфических биотрансформаций стероидов.

Текст статьи

Пожалуйста, введите код, чтобы получить PDF файл с полным текстом статьи: