Кинетический анализ созревания и денатурации красного флуоресцентного белка DsRed^*

Аннотация

Красный флуоресцентный белок DsRed, недавно клонированный из коралла Discosoma sp., характеризуется сдвинутыми в красную область максимумами возбуждения и эмиссии (558 и 583 нм соответственно) и привлекает повышенный интерес, так как является удобным дополнением к набору других флуоресцентных белков, включая зеленый флуоресцентный белок и его улучшенный мутант EGFP. В настоящей работе показано, что медленное созревание DsRed описывается трехстадийной моделью, в то время как более быстрое созревание EGFP описывается одностадийной моделью. При понижении значений pH среды ниже 5,0 происходит подавление флуоресценции DsRed, скорость и глубина которого существенным образом зависят от pH. Кинетика снижения интенсивности флуоресценции удовлетворительно описывается функцией, содержащей сумму двух экспонент; начальная скорость имеет четвертый порядок по концентрации ионов водорода. Обратное подщелачивание среды инкубации приводит к частичному восстановлению флуоресценции. Кинетика реактивации характеризуется лаг-периодом и описывается функцией, содержащей как минимум три экспоненты. Исследование процессов кислотной инактивации и реактивации флуоресценции методами абсорбционной спектроскопии и КД показало, что потеря флуоресценции DsRed при понижении pH сопровождается денатурацией белка. Предложена кинетическая модель, включающая последовательное превращение протонированной четырьмя протонами формы белка с образованием трех интермедиатов, первый из которых обладает флуоресценцией, а последний подвергается необратимой инактивации. Существование DsRed в водных растворах в виде прочных тетрамеров позволяет полагать, что кислотной инактивации подвергаются только те тетрамеры DsRed, в которых каждый мономер протонирован.

Текст статьи

Пожалуйста, введите код, чтобы получить PDF файл с полным текстом статьи: