Аффинная модификация флэп-эндонуклеазы FEN‑1 фотореакционноспособными ДНК

Аннотация

Эукариотическая флэп-эндонуклеаза (FEN-1) – односубъединичный белок с молекулярной массой 42 кДа, относящийся к семейству структурно-специфичных нуклеаз, отщепляет 5′-концевые «свисающие» одноцепочечные участки в разветвленных ДНК-структурах, а также обладает 5′-экзонуклеазной активностью. FEN-1 участвует в процессах репликации, репарации и рекомбинации ДНК. Для исследования взаимодействия FEN-1 с ДНК-структурами, образующимися в процессе репликации и репарации, были использованы фотореакционноспособные олигонуклеотиды двух типов. Олигонуклеотиды, содержащие фотореакционноспособную арилазидогруппу на 3′-конце, были синтезированы in situ с помощью ДНК-полимеразы β и замещенных по основанию фотореакционноспособных аналогов dUTP в качестве субстратов. Фотореакционноспособная группа была также присоединена к 5′-концевой фосфатной группе олигонуклеотида путем химического синтеза. Показано взаимодействие FEN-1 как с 5′-, так и с 3′-концами ДНК, расположенными внутри одноцепочечного разрыва в дуплексе (ника), а также обращенными в сторону одноцепочечных участков матрицы. Образование структуры с 5′-концевым «свисающим» участком, содержащим фотоактивную группу, приводит к резкому снижению уровня модификации белка, связанному с отщеплением фотоактивной группы за счет проявления эндонуклеазной активности FEN-1. Проведена фотоаффинная модификация белков экстракта фибробластов мыши с использованием радиоактивно меченного ДНК-дуплекса, содержащего фотореакционноспособную группу на 3′-конце и апуриновый/апиримидиновый сайт на 5′-конце ника. Такая структура была сформирована под действием клеточных ферментов из исходного ДНК-дуплекса, содержащего остаток 3-гидрокси-2-гидроксиметилтетрагидрофурана, и представляет собой фотореакционноспособный аналог интермедиата, возникающего в процессе репарации ДНК. Показано, что одним из белков, подвергающихся фотомодификации, является FEN-1, что указывает на возможное участие этого фермента в процессе репарации поврежденных оснований.

Текст статьи

Пожалуйста, введите код, чтобы получить PDF файл с полным текстом статьи: