Сайт-направленный мутагенез цитохрома b₅ в исследовании его взаимодействия с цитохромами P450

Аннотация

Ранее нами было показано, что микросомальный цитохром b₅ способен образовывать специфический комплекс с цитохромом P450 митохондриального типа – цитохромом P450scc. Образование этого комплекса доказано спектрофотометрически, аффинной хроматографией на иммобилизованном цитохроме b₅ и измерением активности цитохрома P450scc в реакции отщепления боковой цепи холестерина в реконструированной системе в присутствии цитохрома b₅. С целью дальнейшего изучения механизма взаимодействия двух гемопротеидов и понимания роли, которую играют в этом взаимодействии «кислые» аминокислотные остатки Glu⁴⁸, Glu⁴² и Asp⁶⁵ цитохрома b₅, локализованные в центре, ответственном за взаимодействие с электрон-транспортными белками, мы заменили с помощью сайт-направленного мутагенеза остатки Glu⁴⁸ и Glu⁴² на лизин, а остаток Asp⁶⁵ на аланин. Мутантные формы цитохрома b₅ экспрессированы в E. сoli. Полноразмерные и протеолитически модифицированные формы (укороченные с C-концевой последовательности в результате отщепления 40 аминокислотных остатков) указанных мутантов цитохрома b₅ выделены в высокоочищенном состоянии. Добавление низкомолекулярных форм цитохрома b₅, не содержащих C-концевой гидрофобной последовательности, ответственной за взаимодействие с мембраной, в реконструированную систему, содержащую цитохром P450scc, практически не влияет на активность гемопротеида в реакции отщепления боковой цепи холестерина. В то же время полноразмерный цитохром b₅ и его мутантные формы Glu48Lys и Asp65Ala стимулируют реакцию отщепления боковой цепи холестерина на 100%, указывая на принципиальную роль гидрофобного фрагмента цитохрома b₅ во взаимодействии с цитохромом P450scc и свидетельствуя о том, что остатки Glu⁴⁸ и Asp⁶⁵ цитохрома b₅, по-видимому, не участвуют во взаимодействии с цитохромом P450scc. Замена Glu⁴² на лизин приводит к тому, что мутант Glu42Lys цитохрома b₅ теряет 40% способности стимулировать реакцию отщепления боковой цепи холестерина, катализируемую цитохромом P450scc, указывая на возможное вовлечение остатка Glu⁴² цитохрома b₅ в процесс взаимодействия с цитохромом P450scc. Во взаимодействии с микросомальными цитохромами P450, возможно, принимают участие как Glu⁴², так и Glu⁴⁸ цитохрома b₅.

Текст статьи

Пожалуйста, введите код, чтобы получить PDF файл с полным текстом статьи: