БИОХИМИЯ, 1999, том 64, вып. 12, с. 1668–1678
УДК 577.212.5
Чувствительный метод оценки точности трансляции (сквозного чтения и терминации) в клетках эукариот
Поступила в редакцию 02.06.1999
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: терминация трансляции, сквозное прочтение, фактор терминации, щелочная фосфатаза, S-пептид, eRF1, eRF3, тест-система.
Аннотация
Для исследования терминации трансляции у эукариот используют разные системы анализа, каждая из которых имеет свои достоинства. Нами разработана система in vivo, в которой репортерный белок выделяется клетками, что позволяет следить за ходом процесса терминации трансляции путем анализа культуральной среды. С помощью этой системы можно исследовать влияние различных факторов на терминацию трансляции in vivo и in vitro, воздействуя на растущие клетки. Измерение проводится быстро и просто, не требует разрушения клеток, позволяя исследовать временные изменения трансляции в реальном масштабе времени. Например, с помощью этой системы можно измерять низкие уровни супрессии стоп-кодонов. Репортерный фермент, секретируемая щелочная фосфатаза (SEAP), в случае сквозного прочтения стоп-кодона оказывается соединен с S-пептидом; этот белок связывается с матриксом. Активность связанной SEAP сравнивают с активностью свободной SEAP в культуральной среде. С использованием этой системы мы подтвердили, что фактор eRF1 проявляет антисупрессорную активность как в клетках при внесении супрессорной тРНК, так и в контрольных клетках при низком, но достоверном уровне супрессии. Мы также охарактеризовали супрессию отдельно каждого из трех стоп-кодонов. Наиболее сильно супрессируемым оказался кодон UGA.