БИОХИМИЯ, 1999, том 64, вып. 12, с. 1648–1658
УДК 577.123
Сверхэкспрессия и очистка рекомбинантных белков eRF1 кролика и Tetrahymena thermophila
Поступила в редакцию 10.06.1999
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: терминация трансляции, факторы терминации, eRFl, кролик, Tetrahymena.
Аннотация
Клонирован ген кролика, кодирующий фактор терминации трансляции eRF1, и разработана система его сверхэкспрессии и очистки белкового продукта. Параллельно клонирован ген, кодирующий eRFl Telrahymena thermophila. Белок eRFl кролика (Ra-eRF1), состоящий из 437 аминокислотных остатков, полностью идентичен eRFl человека, хотя нуклеотидные последовательности соответствующих генов различаются на 3%. Напротив, eRFl из тетрахимены (Tt-eRFl) имеет всего 57% гомологии с eRFl человека. Рекомбинантный белок Ra-eRFl с гистидиновой концевой последовательностью сверхэкспрессирован и очищен до гомогенного состояния с использованием двухступенчатой хроматографии на колонках с Ni-NTA-aгaрозой и Mono Q. Белок Tt-eRFl, образующий агрегаты при сверхэкспрессии в Escherichia coli, очищен в денатурирующих условиях и использован для иммунизации кролика. Полученные антитела против Tt-eRFl использованы для исследования растворимой формы Tt-eRFl в клетках. Растворимая форма Tt-eRFl выделена из дрожжей Saccharomyces cerevisiae, трансформированных Tt-eRFl-экспрессирующей плазмидой, и очищена с использованием трехступенчатой аффинной и ионообменной хроматографий. Клонированный ген, кодирующий Ra-eRFl, комплементировал чувствительный к изменениям температуры аллель гена, кодирующего eRFl дрожжей S. cerevisiae, sup45 (ts), хотя комплементирующая активность снижена за счет гистидиновой последовательности. Ген, кодирующий Tt-eRFl, оказался не способен комплементировать аллель sup45 (ts).