БИОХИМИЯ, 1999, том 64, вып. 11, с. 1550–1556
УДК 577.123
Структуры Холлидея образуются в концентрированных растворах очищенных продуктов амплификации ДНК
Поступила в редакцию 03.02.1999
После доработки 11.08.1999
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: ДНК-ДНК-взаимодействие, χ-структуры, структуры Холлидея, ПЦР, электрофорез ДНК.
Аннотация
В наших предыдущих исследованиях на моделях ПЦР-продуктов пяти различных генов было показано, что в растворах очищенных гомологичных фрагментов ДНК появляются структуры с молекулярной массой, приблизительно вдвое большей массы двухцепочечного фрагмента, а также более высокомолекулярные структуры. Поскольку данный феномен наблюдался независимо от размера фрагмента и последовательности нуклеотидов в нем, мы предположили, что он является результатом взаимодействия дуплексов ДНК. Структура ДНК с массой вдвое большей ПЦР-продукта, соответствующая простейшему такому комплексу, содержащему четыре полинуклеотидные цепи двух фрагментов, условно нами была названа «тетрамером». Настоящая работа посвящена дальнейшему изучению структуры и закономерностей образования тетрамеров в растворе очищенного ПЦР-продукта кДНК гена р53. Продемонстрирована зависимость интенсивности образования тетрамеров от концентрации ПЦР-продукта в растворе. При проведении серии повторных очисток ПЦР-продукта путем сорбции на ДНК-связывающем матриксе показано, что после каждой очистки тетрамеры выявляются вновь. После очистки ПЦР-продукта, предварительно обработанного Sl-нуклеазой, также было обнаружено появление тетрамеров, что свидетельствует об участии в формировании комплексов именно двухцепочечных фрагментов ДНК. Очистка тетрамеров с помощью сорбции на ДНК-связывающем матриксе приводила к тому, что основным получаемым продуктом опять был исходный двухцепочечный фрагмент ДНК. С помощью электроэлюции и фильтрации на колонках путем центрифугирования была проведена более быстрая очистка ДНК, что позволило получить раствор с большим содержанием тетрамеров. Электронно-микроскопический анализ полученного раствора тетрамеров выявил наличие в нем симметричных структур с перекрещивающимися цепями, известных как структуры Холлидея. Наше исследование является первой демонстрацией способности гомологичных двухцепочечных ДНК к взаимодействию с образованием структур Холлидея без участия белков.