БИОХИМИЯ, 1999, том 64, вып. 8, с. 1043–1051
УДК 577.353.3
Использование стабильных аналогов промежуточных состояний атразной реакции миозина для кинетических исследований «слабого» связывания головок миозина с актином
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: субфрагмент 1 миозина, F-актин, «слабое» связывание миозина с актином, кинетика, скелетные мышцы.
Аннотация
Известно, что тройные комплексы субфрагмента 1 миозина (S1) с ADP и аналогами Pi – фторидом бериллия (BeFx) или фторидом алюминия (A1F4) являются стабильными аналогами промежуточных состояний АТРазной реакции миозина – М*∙ АТР и М** ∙ ADP ∙ Pi cоответственно. Используя кинетические подходы, мы провели сравнительный анализ сборки комплексов S1 ∙ ADP ∙ BeFx и S1 ∙ ADP ∙ A1F4- в отсутствие и в присутствии F-актина и их взаимодействия с F-актином. Показано, что в отсутствие F-актина сборка комплекса S1 ∙ ADP ∙ BeFx происходит значительно быстрее (3-4 мин), чем сборка комплекса S1 ∙ ADP ∙ A1F4- (часы). Образование этих комплексов в присутствии F-актина приводило к диссоциации S1 от F-актина, которую регистрировали по снижению светорассеяния. При добавлении BeFx снижение светорассеяния комплекса F-актина с S1 происходило значительно быстрее (в течение 1 мин), чем после добавления A1F4- (более 20 мин).В обоих случаях светорассеяние комплекса актин-Sl снижалось на 40-50%, но оно оставалось значительно выше, чем у F-актина в отсутствие S1. Взаимодействие комплексов S1 ∙ ADP ∙ ВеFх и S1 ∙ ADP ∙ A1F4- с F-актином исследовали методом остановленного потока в коротком временном интервале (не более 0,6 с после смешивания S1 с F-актином). Показано, что связывание S1 ∙ ADP ∙ BcFx и S1 ∙ ADP ∙ AlF4 с F-актином сопровождается быстрым приростом светорассеяния, но оно не изменяет флуоресценцию пиреновой метки,специфически присоединенной к F-актину. Сделан вывод, что в исследуемом временном интервале происходит «слабое» связывание комплексов S1 ∙ ADP ∙ BeFx и S1 ∙ ADP ∙ A1F4- с F-актином, но еще не происходит его переход в состояние «сильного» связывания. При сравнительном анализе кинетических кривых роста светорассеяния показано, что S1 ∙ ADP ∙ A1F4 связывается с F-актином быстрее, чем S1 ∙ ADP ∙ BeFx: константы скорости второго порядка для «слабого» связывания с F-актином составляли (62,8 ± 1,8) ∙ 106 М-1с-1 в случае S1 ∙ ADP ∙ A1F4 и (22,6 ± 0,4) ∙ 106 М-1с-1 в случае S1 ∙ ADP ∙ BeFx. Сделано заключение, что стабильные тройные комплексы S1 ∙ ADP ∙ BeFx и S1 ∙ ADP ∙ A1F4 могут быть успешно использованы для кинетических исследований «слабого» связывания головок миозина с актином.