БИОХИМИЯ, 1999, том 64, вып. 7, с. 958–964
УДК 577.123
Определение 8-оксогуанина в ДНК методом хемилюминесцентного иммуноферментного анализа
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: 7, 8-дигидро-8-оксогуанин (8-гидроксигуанин), повреждение ДНК, реактивные формы кислорода, иммуноферментный анализ, усиленная хемилюминесценция, моноклональные антитела.
Аннотация
Разработана тест-система для определения 8-оксогуанина в ДНК как наиболее важного биомаркера повреждения оснований ДНК реактивными формами кислорода. Она основана на хемилюминесцентном иммуноферментном анализе с использованием моноклональных антител (мкАТ) к 8-оксогуанину. Эта система включает в себя ряд этапов. 1. Иммобилизацию ДНК на нитроцеллюлозных Мембранных фильтрах. Для иммобилизации ДНК использован эффективный метод предварительного образования комплекса с протаминсульфатом. 2. Образование комплексов антиген-антитело (мкАт с 8-оксогуанином в ДНК) с вторичными, мостиковыми антителами и с комплексом пероксидаза-антипероксидаза (ПАП-метод). 3. Регистрацию усиленной хемилюминесценции в растворе перекиси водорода, люминола, параиодфенола. Количественное определение усиленной хемилюминесценции проведено с помощью стандартного жидкостного сцинтилляционного счетчика для измерения β-радиоактивности. Эта система протестирована путем определения образования 8-оксогуанина в ДНК при γ-облучении и при фотосенсибилизированном окислении гуанина под действием видимого света в присутствии метиленового голубого. Показана линейная зависимость образования 8-оксогуанина в ДНК от дозы при γ-облучении. Радиационно-химический выход образования 8-оксогуанина (G = 0,57 молекул на 100 эВ) удобно использовать для калибровки определения 8-оксогуанина при других воздействиях. Чувствительность метода позволяет определять единицы фемтомолей 8-оксогуанина в образце ДНК (40 мкг).