БИОХИМИЯ, 1999, том 64, вып. 4, с. 447–453
УДК 577.123
PCR-фрагментация ДНК
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: PCR - амплификация ДНК, Taq - полимераза, фрагмент Кленова.
Аннотация
Предложен метод получения случайных фрагментов ДНК с помощью PCR. Сначала проводятся два цикла при 16° с помощью фрагмента Кленова и олигонуклеотидами со случайной последовательностью на З’-конце (рассеянные праймеры), в константной части которых заложен сайт для используемой при клонировании сайтпецифической эндонуклеазы. Рассеянный праймер способен З’-концом присоединяться к любым участкам ДНК, и в результате синтеза образуются случайные фрагменты. После денатурации ДНК и добавления фрагмента Кленова на втором цикле рассеянный праймер может присоединяться к вновь синтезированным цепям ДНК и после синтеза образуются одноцепочечные фрагменты ДНК, на 5 ‘-конце которых имеется константная последовательность, а на З’-конце – комплементарная ей. На третьем цикле добавляется константный праймер и при синтезе Д НК образуются двухцепочечные фрагменты с последовательностями константного праймера на обоих концах фрагментов. При одночасовой инкубации при 37° олигонуклеотиды, используемые на первой стадии, деградируют за счет экзонуклеазной активности фрагмента Кленова. После этого проводится обычная PCR с использованием константного праймера. Этот метод имеет существенные преимущества перед широко используемыми при клонировании методом «дробовика» гидродинамическими методами разрушения ДНК.