БИОХИМИЯ, 1998, том 63, вып. 4, с. 524–531
УДК 577.15.02
Использование метода термоденатурации для изучения аддуктов α-химотрипсина с полиалкиленоксидами
Поступила в редакцию 09.07.1997
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: термостабильность, α-химотрипсин, полиэтиленгликоль, проксанол, комплексообразование, флуоресцентная спектроскопия.
Аннотация
Проведено сравнительное изучение термостабильности конъюгатов, нековалентных комплексов и смесей α-химотрипсина (α-XT) с полиалкиленоксидами – полиэтиленгликолем (ПЭГ) с молекулярной массой 1,9 кДа и двухблочным сополимером оксидов этилена и пропилена (проксанолом). Было показано, что добавление к раствору α-XT ПЭГ в концентрации до 2% не влияет на скорость термоинактивации фермента, в то время как добавление проксанола в той же концентрации приводит к снижению константы скорости термоинактивации k2 в 2 раза. Для комплексов α-XT с проксанолом, полученных как при нагревании, так и под действием повышенного давления, наблюдалось более существенное снижение скорости инактивации. При этом для комплексов, полученных при нагревании, стабилизирующий эффект возрастал с увеличением температуры получения комплекса, а для комплексов, полученных под действием повышенного давления, – с ростом давления. Наибольший стабилизирующий эффект наблюдался для комплекса, полученного в результате нагревания компонентов до 52° и содержащего максимальное число полимерных цепей (молярное соотношение проксанол : α-XT составляло 10). Для этого комплекса наблюдалось уменьшение величины k2в 4 раза. Ковалентное присоединение ПЭГ и проксанола к ферменту приводит к еще более высоким стабилизирующим эффектам, характеризующимся уменьшением величины k2 на порядок. Изучение кинетики термической денатурации α-XT и его аддуктов с полиалкиленоксидами с помощью метода флуоресцентной спектроскопии показало, что присутствие полимерных цепей практически не оказывает влияния на скорость денатурации белка, регистрируемую по уменьшению интенсивности белковой флуоресценции. По-видимому, благодаря защитному действию полимерных цепей замедляется плавление участков белковой глобулы, содержащих активный центр фермента, в то время как общая скорость денатурации не зависит от наличия полимерных цепей вблизи белковой глобулы.