БИОХИМИЯ, 1998, том 63, вып. 2, с. 265–276
УДК 577.23
Сравнительная структурная и иммунохимическая характеристика рекомбинантного и природного цитохромов P450scc (CYPXIAI)
Поступила в редакцию 28.07.1997
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: цитохром P450scc, гетерологическая экспрессия, стабилизация субстратом, фолдинг, конформационная подвижность белков.
Аннотация
Оптимизацией условий достигнут уровень гетерологической экспрессии рекомбинантного бычьего цитохрома P450scc, равный 420 нмоль/л культуры клеток Е. coli.Предложены способы очистки рекомбинантного белка в субстратсвязанной высокоспиновой и в свободной от субстрата низкоспиновой формах. Электрофоретически гомогенные препараты рекомбинантного цитохрома P450scc содержат 12,3 и 16,7 нмоль гема на 1 мг белка для субстрат-свободной и субстратсвязанной форм соответственно. Проведена сравнительная функциональная и иммунохимическая характеристика рекомбинантного и природного цитохрома P450scc из митохондрий коры надпочечников быка. Определены кажущиеся константы диссоциации их комплексов с холестерином, адренодоксином, эффективность ферментативного восстановления в реконструированной системе (NADPH-адренодоксин-редуктаза-адренодоксин) и холестерингидроксилирующая активность. Показано, что при ограниченном протеолизе рекомбинантного цитохрома P450scc трипсином образуются два фрагмента, электрофоретически и иммунохимически идентичные фрагментам F1 (29,8 кДа) и F2 (26,6 кДа) природного белка. Количественные значения исследованных характеристик оказались практически одинаковыми у природного и связанного с субстратом рекомбинантного цитохрома P450scc, в то же время между субстратсвязанной и субстратсвободной формами рекомбинантного белка наблюдались существенные различия как функционального (снижение у последнего холестерин-гидроксилирующей активности, эффективности ферментативного восстановления в реконструированной системе и сродства к адренодоксину), так и структурного характера (увеличение доступности экзо- и эндогенному протеолизу). Обсуждается проблема идентичности фолдинга природного и рекомбинантного белков, а также природа стабилизирующего и активирующего действия субстрата на молекулу цитохрома P450scc.