БИОХИМИЯ, 1996, том 61, вып. 10, с. 1758–1771
УДК 577.023
Экспрессия функционально активного цитохрома P-450с21 (CYPXXIA2) человека в Escherichia coli и его одностадийная очистка с помощью металлоаффинной хроматографии
Поступила в редакцию 04.10.1995
После доработки 10.02.1996
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: цитохром Р-450с21, экспрессия в Escherichia соli, металлоаффинная хроматография, очистка, стероиды.
Аннотация
Ферментативно активный цитохром Р-450с21 экспрессирован в Escherichia coli и очищен до гомогенного состояния. С целью увеличения уровня экспрессии, осуществлены замены в последовательности кДНК, кодирующей цитохром Р-450с21 человека, которая соответствует N-концевому фрагменту молекулы гемопротеида. Последовательность кДНК, соответствующая С-концевой последовательности белка, модифицирована введением дополнительных четырех кодонов, кодирующих гистидин, для эффективной и быстрой очистки рекомбинантного белка с помощью металлоаффинной хроматографии. Модифицированный цитохром Р-450с21 человека, детектируемый спектрофотометрически, экспрессируется в количестве 4 0 -5 0 нмоль на 1 л культуры и, как было найдено, встраивается в бактериальные мембраны. Модификация N- и С-концевых последовательностей цитохрома Р-450с21 не приводит к изменению Кт и Vmax для реакции гидроксилирования прогестерона и 17α-оксипрогестерона в реконструированной системе. Экспрессированный в Escherichia coli цитохром Р-450с21 очищен до гомогенного состояния из солюбилизированных бактериальных мембран посредством металлоаффинной хроматографии. Очищенный цитохром Р-450 мигрирует в полиакриламидном геле одной полосой, соответствующей молекулярной массе 54 кДа и характеризуется первым типом спектральных изменений при взаимодействии как с 17α-оксипрогестероном, так и прогестероном. Ферментативная активность очищенного цитохрома Р-450 реконструирована добавлением очищенной NADPН-цитохром Р-450-редуктазы из микросом печени мышей и NADPH-регенерирующей системы. Значение Кт для очищенного фермента оказалось равным 12,2 мкМ для 17α-оксипрогестерона и 3,21 мкМ для прогестерона, a Vmax – 192,9 нмоль/мин на 1 нмоль Р-450с21 и 198 нмоль/мин на 1 нмоль Р-450с21 соответственно. Константа диссоциации, определенная из спектров титрования, для 17α -оксипрогестерона равна 31,1 мкМ, а для прогестерона – 14,7 мкМ.