БИОХИМИЯ, 1996, том 61, вып. 8, с. 1512–1525
УДК 577.152.1
Влияние мембран эритроцитов и тубулина на активность NAD-зависимых дегидрогеназ
Поступила в редакцию 25.03.1996
После доработки 12.04.1996
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: лактатдегидрогеназа, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, тубулин, белок полосы 3, мембраны эритроцитов, седиментационный анализ, иммобилизованные белки.
Аннотация
Исследованы особенности взаимодействия NAD-зависимых дегидрогеназ (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы – ГАФД и лактатдегидрогеназы – ЛДГ) с белком полосы 3 мембраны эритроцитов и с тубулином. Показано, что при низкой ионной силе и ненасыщающих концентрациях субстратов ЛДГ прочно связывается с тубулином, что приводит к инактивации фермента. Величины Кd, рассчитанные из опытов по ингибированию и по прямому связыванию, равны соответственно 15,0 и 13,6 нМ; стехиометрия связывания – 1,66 молей димера тубулина на тетрамер ЛДГ. В присутствии 0,15 М NaCl ЛДГ не связывается с тубулином и тубулин не оказывает ингибирующего влияния на активность фермента. При низкой ионной силе влияние мембран эритроцитов на обе дегидрогеназы сходно с воздействием на них тубулина. Активность ГАФД полностью ингибируется избытком мембран эритроцитов (или добавлением избытка цитоплазматического фрагмента белка полосы 3). В тех же условиях добавление мембран эритроцитов снижает активность ЛДГ на 70%. При этом в расчете на 100 мкг белка эритроцитов связывается около 1 нмоля тетрамеров ГАФД или 1,8 нмолей тетрамеров ЛДГ (Кd равны соответственно 0,13 и 0,6 мкМ). Повышение ионной силы (0,15 М NaCl) полностью снимает ингибирующее действие мембран эритроцитов на дегидрогеназы, однако взаимодействие с ними ГАФД и ЛДГ сохраняется. В этих условиях Кd для ГАФД увеличивается до 4,43 мкМ без существенного изменения количества связывающегося на мембране фермента (0,75 нмолей тетрамеров на 100 мкг белка мембран). Кd для ЛДГ не изменяется (0,76 мкМ), но уменьшается количество связывающегося на мембране белка (до 0,48 нмолей тетрамеров на 100 мкг белка). Предполагается, что при низкой ионной силе «кислые хвосты» белка полосы 3 и тубулина взаимодействуют с положительно-заряженными областями NAD-связывающих доменов обеих дегидрогеназ, вызывая ингибирование их активности. Повышение ионной силы влияет на такие взаимодействия, ослабляя связывание ферментов и устраняя ингибирование их активности. Можно полагать, что при «физиологических» значениях ионной силы ГАФД и ЛДГ в каталитически активном состоянии могут адсорбироваться в различных участках мембраны эритроцитов. Эго может играть определенную роль в регуляции передачи общего кофактора (NAD/NADH) между их активными центрами.