БИОХИМИЯ, 1996, том 61, вып. 1, с. 89–99
УДК 577.153
Выделение и некоторые свойства мутантных щелочных фосфатаз Escherichia coli
Поступила в редакцию 21.06.1995
После доработки 01.10.1995
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: E coli, щелочная фосфатаза, транслокация через внешнюю мембрану, кинетические параметры.
Аннотация
Из периплазмы и культуральной жидкости Е. coli выделены природная и мутантные щелочные фосфатазы, имеющие замены аминокислот в сайте процессинга и в N-концевом домене зрелой полипептидной цепи: Alа-1 на Val, Glu+4 на Gln и одновременно Glu+4 на Gln и Arg+1 на Ala. Показано, что указанные замены незначительно влияют на зависимость активности фермента от pH, ионной силы и температуры, но влияют на его изоферментный спектр и почти вдвое снижают максимальную скорость катализируемой им реакции. Внеклеточные ферменты по сравнению с периплазменными обладают иными каталитическими ( Vmах) и связывающими (Km) свойствами. После транслокации через наружную мембрану, у всех ферментов снижается Vmax и повышается Kш. Наибольшие изменения претерпевает мутантный белок PhoA46, содержащий неотщепленный сигнальный пептид вследствие нарушения процессинга, вызванного заменой Ala—1 на Val. Для него Vmах снижается в 20 раз и Кт повышается в 4 раза. Он проявляет также большую, чем другие белки, чувствительность к протеолитическим ферментам и менее устойчив при хранении. Результаты свидетельствуют, что изменения в N-концевой области щелочной фосфатазы, далеко отстоящей от ее активного центра, влияют на функционирование фермента