БИОХИМИЯ, 1990, том 55, вып. 9, с. 1675–1689
УДК 577.175.8
Очистка и некоторые физико-химические и энзиматические свойства тканевого калликреина из мочи человека
Институт биологической и медицинской химии АМН СССР, Москва
Поступила в редакцию 24.11.1989
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: тканевой калликреин, очистка, ингибирование, апротинин, диизопропилфторфосфат.
Аннотация
Описан способ получения высокоочищенного препарата тканевого калликреина (КФ 3.4.21.35) из больших объемов мочи человека (100 л), включающий первичное извлечение фермента из мочи адсорбцией на хитозане (деацилированный щелочной обработкой хитин ракообразных), десорбцию с хитозана 1 М NH3, аффинную хроматографию на контрикал-сефарозе, ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-сефарозе и гель-фильтрацию на сефадексе G-100. Этот способ позволяет получить препарат тканевого калликреина со степенью очистки в 1080 раз по AcPheArg-OEt-эстеразной и в 1360 раз по кининогеназной активности, с выходом 33 и 40% соответственно. Препарат тканевого калликреина гомогенен по данным электрофореза в 12%-ном ПААГ в присутствии 0,1%-ного DS-Na, а также по наличию одной N-концевой аминокислоты, идентифицированной как изолейцин. Очищенный препарат тканевого калликреина из мочи характеризуется следующими значениями удельных активностей: 133 мкмоль/мин · мг белка по гидролизу AcPheArg-OEt, 8,8 — по гидролизу D-Val-Leu-Arg-pNA и освобождает 462 мкг-экв брадикинина/мин · мг белка из прогретой плазмы крови человека как источника кининогена. Наибольшей pH-стабильностью тканевой калликреин из мочи человека обладает при pH 8,0—9,0; pH-оптимум его действия при использовании в качестве субстрата AcPheArg-OMe находится при pH 8,0. Полученный фермент обладает высокой термостабильностью; полная его инактивация наступает только после 1-часового нагревания на кипящей водяной бане. Принадлежность полученного из мочи фермента к калликреину тканевого типа следует из данных устойчивости его энзиматической активности к СИТ, высокой чувствительности к ингибирующему действию апротинина (Ki = 0,94 · 10−10 М), а также крайне низкой величины константы скорости ингибирования второго порядка под действием ДФФ (4,6 М−1 ·мин−1). Существенные отличия этой последней величины от соответствующей константы (360 М−1 · мин−1). найденной для калликреина плазмы крови человека (КФ 3.4,21.34), свидетельствуют о значительных различиях в строении активных центров двух калликреинов и об уникальности активного центра тканевого калликреина.