БИОХИМИЯ, 1990, том 55, вып. 2, с. 323–328
УДК 577.152.4
Выделение и свойства фумаразы из дрожжей Pichia membranaefaciens
Институт биохимии им. Баха АН СССР, Москва
Поступила в редакцию 05.08.1988
После доработки 14.10.1988
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: фумараза.
Аннотация
Разработан метод выделения гомогенного препарата фумаразы (КФ 4.2.1.2) из дрожжей Pichia membranaefaciens ВКМ Y1259. Метод включает следующие стадии: фракционирование ацетоном, кислотное осаждение, ионообменную хроматографию и высокоэффективное хроматофокусированне с использованием системы FPLC. Фермент представляет собой тетрамер с молекулярной массой субъединицы 48,5 кДа. Изоэлектрическая точка соответствует ~6,5 pH. Фермент стабилен при низких температурах, при температуре выше 50° наблюдается быстрая инактивация. Оптимум pH для реакции малат—фумарат 7,6, а для обратной реакции наблюдается плато в интервале 5,8—7,0 pH. Для реакции малат—фумарат Vm = 160 мкмоль/мин на 1 мг белка и Km = 0,13 ± 0,02 мМ; для обратной реакции — 105 мкмоль/мин на 1 мг белка и 0,025 ± 0,010 мМ соответственно. При концентрации субстратов выше 5 Km наблюдаются отрицательные кооперативные эффекты (увеличение Vm в 7—8 раз). Активация субстратом не связана с увеличением ионной силы или изменением олигомерного состояния фермента. Влияние многозарядных анионов (фосфата, сукцината) имеет сложный характер: увеличение Vm на фоне конкурентного ингибирования при линеаризации формы зависимости 1/V от 1/S.