сАМР-зависимая протеинкиназа из грудной мышцы голубя. Выделение регуляторной субъединицы методом аффинной хроматографии и изучение топографии сАМР-связывающего центра с помощью аналогов сАМР

Аннотация

cAMP-зависимая протеинкиназа растворимой клеточной фракции грудной мышцы голубя представлена двумя видами фермента — ПКI и ПКII^*. Соотношение этих форм по фосфотрансферазной активности составляет 35—40% для протеинкиназы типа I и 60—65% для протеинкиназы типа II. Регуляторная субъединица типа I получена в гомогенном состоянии методом аффинной хроматографии на 8-(2-оксиэтилтио)-cAMP, иммобилизованном на эпоксиактивированной сефарозе 4B. Молекулярный вес регуляторной субъединицы типа I, определенный методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии DS-Na, равен 45000. Удельная с АМР-связывающая активность составляла 16 нмоль [³H]cAMP на 1 мг белка. Кажущаяся константа диссоциации (К_д′) для cAMP равна 380 нМ. Препарат регуляторной субъединицы типа II получен методом аффинной хроматографии на том же носителе в виде набора полипептидов с молекулярными весами 56000, 39000, 29000, 17000, 11000. Препарат обладал cAMP-связывающей активностью, равной 22 нмоль [³H]cAMP на 1 мг белка. Изучено взаимодействие ряда аналогов cAMP, содержащих заместители в различных положениях молекулы, с регуляторной субъединицей типа I. Практически все аналоги, имеющие заместители по 8- и 6-положениям аденинового кольца молекулы cAMP, обладали сродством в 2—9 раз худшим, чем cAMP. Исключение составляли 8-карбоксиметиламино- и 8-(2-оксиэтил)-амино-cAMP, которые связывались с регуляторной субъединицей в 100 и 53 раза хуже, чем cAMP. Замещения по N-1-положению молекулы cAMP приводили к снижению сродства аналогов в 30—50 раз. β-Бромэтиловый эфир cAMP не обладал способностью связываться с регуляторной субъединицей. Карбоксиметиловый эфир cAMP имел сродство к cAMP-связывающему центру в 35 раз меньшее по сравнению с cAMP. Модификации 2′-гидроксильной группы рибозы, как в случае 2 -амино-2 -дезокси-8-окси-cAMP, 2 -дезокси-cAMP и 2 -O-акрилил-cAMP, приводили к снижению сродства указанных соединений в 125, 313 и 126 раз по сравнению с cAMP. Предполагается, что молекула cAMP связывается с регуляторной субъединицей в син-конформации. Предложена модель строения cAMP-связывающего центра регуляторной субъединицы cAMP-зависимой протеинкиназы типа I из грудной мышцы голубя.

Текст статьи

Пожалуйста, введите код, чтобы получить PDF файл с полным текстом статьи: