БИОХИМИЯ, 1982, том 47, вып. 7, с. 1070–1083
УДК 577.1 + 547.963
11β-стероидгидроксилирующий цитохром P-450 из митохондрий коры надпочечников быка: выделение, физико-химические и функциональные характеристики
Аннотация
Показано, что из двух цитохромов P-450 — холестерингидроксилирующего (ХГ) и 11β-стероидгидроксилирующего (11β), участвующих в митохондриальном стероидогенезе в клетках коры надпочечников, цитохром P-450 (11β) более прочно связан с мембраной. Установлено, что количественное соотношение цитохромов P-450 (ХГ) / P-450 (11β) в митохондриальной мембране составляет 2:1. Детально описан метод выделения цитохрома P-450 (11β), который включает две основные стадии: разделение цитохромов P-450 (ХГ) и P-450 (11β) фракционированием сульфатом аммония в присутствии холата натрия и твина 80 и аффинную хроматографию на адренодоксин-сефарозе, позволяющую получать в одну хроматографическую стадию высокоочищенный препарат цитохрома P-450 (11β). Полученный белок имеет удельное содержание гема 19 нмоль на 1 мг белка, минимальный молекулярный вес 47000, гомогенен по данным электрофореза в ПААГ в присутствии DS-Na и N-концевого анализа, обладает спектральными свойствами высокоспинового гемопротеида и высокоактивен в реакции гидроксилирования стероидных субстратов. Каталитические константы гидроксилирования дезоксикортикостерона (ДОК), 11-дезоксикортизола и тестостерона составляют 0,69, 0,54 и 0,21 с-1 соответственно. Использование адренодоксина, обладающего стабилизирующим действием, позволяет получать цитохром P-450 (11β), свободный от субстрата (низкоспиновая форма), путем промывки сорбированного на адренодоксин-сефарозе гемопротеида большими объемами фосфатного буфера, не содержащего стероида. Элюированный цитохром P-450 (11β) имеет спектральные свойства, характерные для низкоспинового гемопротеида; добавление ДОК. вызывает спектральные изменения 1-го типа. Константы диссоциации комплекса цитохром P-450 (11β)—стероид, определенные методом спектрофотометрического титрования, для ДОК и тестостерона при 10° составляют 0,32 и 0,67 мкМ соответственно.