Изучение конформационных изменений спин-меченых нативной и модифицированной фосфорилазы Б

Аннотация

Исследовали фосфорилазу Б, меченную 2,2,6,6-тетраметилпиперидин-1-оксил-4-йодацетамидом (фосфорилаза-I) и 2,2,6,6-тетраметилпиперидин-1-оксил-4-этилмалеинимидом (фосфорилаза-II), и показали, что метка I ха­рактеризуется большей степенью подвижности относительно белка, чем метка II. В спин-меченых препаратах фосфорилазы Б модифицированы 1,5—2,0 SH-группы (в мономере фермента), не влияющие на ферментатив­ную активность. Изучали влияние АМР, глюкозо-1-фосфата и глюкозо-6-фосфата на спектр ЭПР фосфорилазы-1 и обнаружили, что наиболее замет­ные изменения формы спектра, особенно высокопольной компоненты, на­блюдаются в присутствии глюкозо-6-фосфата. Эти изменения обусловлены увеличением степени анизотропии вращения метки. Показали сходство экс­периментальных и теоретических спектров, позволивших определить время вращательной корреляции белка (τ_б= 160 нс) и доказать, что локальные конформационные изменения происходят вблизи одной из двух связанных с меткой SH-групп фосфорилазы-I. На основе спектров ЭПР установили S-образный характер зависимости подвижности метки фосфорилазы-I от концентрации глюкозо-6-фосфата (0,1—10 мМ). В присутствии АМР S-образная зависимость не обнаруживается. Восстановленная NaBH₄ фосфорилаза-I не имеет S-образной зависимости подвижности метки от концент­рации глюкозо-6-фосфата. Степень иммобилизации метки в комплексе апофосфорилазы-I с пиридоксаль-5′-хлорметилфосфонатом в присутствии глюкозо-6-фосфата и АМР такая же, как в холофосфорилазе-I, но в отличие от холофермента не зависит от глюкозо-6-фосфата (0,1—10,0 мМ). Полу­ченные изменения подвижности спин-метки апофосфорилазы-I и ее комплек­са с аналогом АМР, аденозин-5′-хлорметилфосфонатом, при реконструкции холофермента с пиридоксальфосфатом демонстрируют участие АМР и фос­фатной группы АМР в формировании активного центра фермента.

Текст статьи

Пожалуйста, введите код, чтобы получить PDF файл с полным текстом статьи: