БИОХИМИЯ, 2024, том 89, вып. 2, с. preprint-05

УДК 577.15

Редокс-регулируемая гетеродимерная NADH:циннамат редуктаза из Vibrio ruber

© 2024 Ю.В. Берцова 1, М.В. Серебрякова 1, В.А. Анашкин 1, А.А. Байков 1, А.В. Богачев 1*bogachev@belozersky.msu.ru

НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, 119234 Москва, Россия

Поступила в редакцию 24.06.2023
После доработки 09.10.2023
Принята к публикации 10.10.2023

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: активные формы кислорода, анаэробное дыхание, коричная кислота, кофейная кислота, регуляция ферментативной активности, ризосфера, Vibrio.

Аннотация

Гены редуктаз несопряженных карбоновых кислот широко распределены среди геномов анаэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов. Однако субстратная специфичность экспериментально определена лишь для небольшого количества этих белков. В ходе данной работы мы наработали в клетках Escherichia coli гетеродимерный белок факультативно-анаэробной морской бактерии Vibrio ruber (GenBank SJN56019 и SJN56021; аннотированные как NADPH азоредуктаза и уроканатредуктаза соответственно) путем его копродукции с флавин трансферазой из Vibrio cholerae. Полученный белок (названный Crd) состоит из sjn56021-кодируемой субъединицы CrdB (домены NADH:flavin, FAD binding 2 и FMN bind) и из дополнительной субъединицы CrdA (SJN56019, единственный домен NADH:flavin), которые взаимодействуют посредством своих доменов NADH:flavin (предсказание Alphafold2). Показано, что каждый домен Crd содержит флавиновую простетическую группу (в сумме три FMN и один FAD), одна из FMN-групп присоединяется к CrdB ковалентно за счет активности флавин трансферазы. В анаэробных условиях Crd способен восстанавливать циннамат, п‑кумарат, кофеат и ферулат, используя NADH или метилвиологен в качестве доноров электронов. Белок также умеренно активен по отношению к акрилату, но практически не способен к восстановлению фумарата и уроканата. Различные (гидрокси)циннаматы индуцируют синтез Crd в клетках V. ruber как в анаэробных, так и в аэробных условиях выращивания. При старте Crd-катализируемой реакции добавкой NADH наблюдается временной лаг в несколько минут, что указывает на редокс-регуляцию ферментативной активности. Показано, что окисленная форма Crd неактивна, что, по-видимому, предотвращает продукцию ферментом активных форм кислорода в аэробных условиях. Полученные данные позволяют описать Crd как регулируемую NADH-зависимую циннаматредуктазу, по-видимому, защищающую V. ruber от токсического действия (гидрокси)циннаматов.

Текст статьи

Пожалуйста, введите код, чтобы получить PDF файл с полным текстом статьи:

captcha

Сноски

* Адресат для корреспонденции

Финансирование

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 22-24-00133).

Благодарности

MALDI-MS и лазерный сканер были доступны для нас в результате реализации Программы развития Московского государственного университета 5.13. Эта работа посвящена светлой памяти Владимира Петровича Скулачева.

Вклад авторов

А.В. Богачев – концепция работы; Ю.В. Берцова, М.В. Серебрякова, В.А. Анашкин, А.А. Байков, А.В. Богачев – получение результатов и анализ данных; А.А. Байков и А.В. Богачев – написание и редактирование текста статьи.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Дополнительные материалы

Приложение к статье на английском языке опубликовано на сайте издательства Springer (https://doi.org/10.1134/S0006297924020056), том 89, вып. 2, 2024.

Список литературы

1. Tischer, W., Bader, J., and Simon, H. (1979) Purification and some properties of a hitherto-unknown enzyme reducing the carbon-carbon double bond of α,β-unsaturated carboxylate anions, Eur. J. Biochem., 97, 103-12, doi: 10.1111/j.1432-1033.

2. Besteiro, S., Biran, M., Biteau, N., Coustou, V., Baltz, T., Canioni, P., and Bringaud, F. (2002) Succinate secreted by Trypanosoma brucei is produced by a novel and unique glycosomal enzyme, NADH-dependent fumarate reductase, J. Biol. Chem., 277, 38001-38012, doi: 10.1074/jbc.M201759200.

3. Bertsova, Y. V., Oleynikov, I. P., and Bogachev, A. V. (2020) A new water-soluble bacterial NADH: fumarate oxidoreductase, FEMS Microbiol. Lett., 367, fnaa175, doi: 10.1093/femsle/fnaa175.

4. Bertsova, Y. V., Serebryakova, M. V., Baykov, A. A., and Bogachev, A. V. (2022) A novel, NADH-dependent acrylate reductase in Vibrio harveyi, Appl. Environ. Microbiol., 88, e0051922, doi: 10.1128/aem.00519-22.

5. Bertsova, Y. V., Kostyrko, V. A., Baykov, A. A., and Bogachev, A. V. (2014) Localization-controlled specificity of FAD:threonine flavin transferases in Klebsiella pneumoniae and its implications for the mechanism of Na+-translocating NADH:quinone oxidoreductase, Biochim. Biophys. Acta, 1837, 1122-1129, doi: 10.1016/j.bbabio.2013.12.006.

6. Serebryakova, M. V., Bertsova, Y. V., Sokolov, S. S., Kolesnikov, A. A., Baykov, A. A., and Bogachev, A. V. (2018) Catalytically important flavin linked through a phosphoester bond in a eukaryotic fumarate reductase, Biochimie, 149, 34-40, doi: 10.1016/j.biochi.2018.03.013.

7. Rohdich, F., Wiese, A., Feicht, R., Simon, H., and Bacher, A. (2001) Enoate reductases of Clostridia. Cloning, sequencing, and expression, J. Biol. Chem., 276, 5779-5787, doi: 10.1074/jbc.M008656200.

8. Kuno, S., Bacher, A., and Simon, H. (1985) Structure of enoate reductase from a Clostridium tyrobutyricum (C. spec. La1), Biol. Chem. Hoppe Seyler, 366, 463-472, doi: 10.1515/bchm3.1985.366.1.463.

9. Caldeira, J., Feicht, R., White, H., Teixeira, M., Moura, J. J., Simon, H., and Moura, I. (1996) EPR and Mössbauer spectroscopic studies on enoate reductase, J. Biol. Chem., 271, 18743-18748, doi: 10.1074/jbc.271.31.18743.

10. Giesel, H., and Simon, H. (1983) On the occurrence of enoate reductase and 2-oxo-carboxylate reductase in clostridia and some observations on the amino acid fermentation by Peptostreptococcus anaerobius, Arch. Microbiol., 135, 51-57, doi: 10.1007/BF00419482.

11. Mordaka, P. M., Hall, S. J., Minton, N., and Stephens, G. (2018) Recombinant expression and characterisation of the oxygen-sensitive 2-enoate reductase from Clostridium sporogenes, Microbiology (Reading), 164, 122-132, doi: 10.1099/mic.0.000568.

12. Shieh, W. Y., Chen, Y. W., Chaw, S. M., and Chiu, H. H. (2003) Vibrio ruber sp. nov., a red, facultatively anaerobic, marine bacterium isolated from sea water, Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 53, 479-484, doi: 10.1099/ijs.0.02307-0.

13. Bogachev, A. V., Bertsova, Y. V., Bloch, D. A., and Verkhovsky, M. I. (2012) Urocanate reductase: Identification of a novel anaerobic respiratory pathway in Shewanella oneidensis MR-1, Mol. Microbiol., 86, 1452-1463, doi: 10.1111/mmi.12067.

14. Light, S. H., Méheust, R., Ferrell, J. L., Cho, J., Deng, D., Agostoni, M., Iavarone, A. T., Banfield, J. F., D’Orazio, S. E. F., and Portnoy, D. A. (2019) Extracellular electron transfer powers flavinylated extracellular reductases in Gram-positive bacteria, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 116, 26892-26899, doi: 10.1073/pnas.1915678116.

15. Bogachev, A. V., Baykov, A. A., and Bertsova, Y. V. (2018) Flavin transferase: the maturation factor of flavin-containing oxidoreductases, Biochem. Soc. Trans., 46, 1161-1169, doi: 10.1042/BST20180524.

16. Koike, H., Sasaki, H., Kobori, T., Zenno, S., Saigo, K., Murphy, M. E., Adman, E. T., and Tanokura, M. (1998) 1.8 Å crystal structure of the major NAD(P)H:FMN oxidoreductase of a bioluminescent bacterium, Vibrio fischeri: overall structure, cofactor and substrate-analog binding, and comparison with related flavoproteins, J. Mol. Biol., 280, 259-273, doi: 10.1006/jmbi.1998.1871.

17. Bertsova, Y. V., Kulik, L. V., Mamedov, M. D., Baykov, A. A., and Bogachev, A. V. (2019) Flavodoxin with an air-stable flavin semiquinone in a green sulfur bacterium, Photosynth. Res., 142, 127-136, doi: 10.1007/s11120-019-00658-1.

18. Bertsova, Y. V., Fadeeva, M. S., Kostyrko, V. A., Serebryakova, M. V., Baykov, A. A., and Bogachev, A. V. (2013) Alternative pyrimidine biosynthesis protein ApbE is a flavin transferase catalyzing covalent attachment of FMN to a threonine residue in bacterial flavoproteins, J. Biol. Chem., 288, 14276-14286, doi: 10.1074/jbc.M113.455402.

19. Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature, 227, 680-685, doi: 10.1038/227680a0.

20. Ells, A. H. (1959) A colorimetric method for the assay of soluble succinic dehydogenase and pyridinenucleotide-linked dehydrogenases, Arch. Biochem. Biophys., 85, 561-562, doi: 10.1016/0003-9861(59)90527-2.

21. Jumper, J., Evans, R., Pritzel, A., Green, T., Figurnov, M., Ronneberger, O., Tunyasuvunakool, K., Bates, R., Žídek, A., Potapenko, A., Bridgland, A., Meyer, C., Kohl, S. A. A., Ballard, A. J., Cowie, A., Romera-Paredes, B., Nikolov, S., Jain, R., Adler, J., Back, T., Petersen, S., Reiman, D., Clancy, E., Zielinski, M., Steinegger, M., Pacholska, M., Berghammer, T., Bodenstein, S., Silver, D., Vinyals, O., Senior, A. W., Kavukcuoglu, K., Kohli, P., and Hassabis, D. (2021) Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold, Nature, 596, 583-589, doi: 10.1038/s41586-021-03819-2.

22. Mirdita, M., Schütze, K., Moriwaki, Y., Heo, L., Ovchinnikov, S., and Steinegger, M. (2022) ColabFold: making protein folding accessible to all, Nat. Meth., 19, 679-682, doi: 10.1038/s41592-022-01488-1.

23. Trott, O., and Olson, A. J. (2010) AutoDock Vina: improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization, and multithreading, J. Comput. Chem., 31, 455-461, doi: 10.1002/jcc.21334.

24. Case, D.A., Aktulga, H. M., Belfon, K., Ben-Shalom, I. Y., Berryman, J. T., Brozell, S. R., et al. (2022) Amber 2022, University of California, San Francisco.

25. Bolanos-Garcia, V. M., and Davies, O. R. (2006) Structural analysis and classification of native proteins from E. coli commonly co-purified by immobilised metal affinity chromatography, Biochim. Biophys. Acta, 1760, 1304-1313, doi: 10.1016/j.bbagen.2006.03.027.

26. Bertsova, Y. V., Serebryakova, M. V., Baykov, A. A., and Bogachev, A. V. (2021) The flavin transferase ApbE flavinylates the ferredoxin:NAD+-oxidoreductase Rnf required for N2 fixation in Azotobacter vinelandii, FEMS Microbiol. Lett., 368, fnab130, doi: 10.1093/femsle/fnab130.

27. Hertzberger, R., Arents, J., Dekker, H. L., Pridmore, R. D., Gysler, C., Kleerebezem, M., and de Mattos, M. J. (2014) H2O2 production in species of the Lactobacillus acidophilus group: a central role for a novel NADH-dependent flavin reductase, Appl. Environ. Microbiol., 80, 2229-2239, doi: 10.1128/AEM.04272213.

28. Kim, S., Kim, C. M., Son, Y. J., Choi, J. Y., Siegenthaler, R. K., Lee, Y., Jang, T. H., Song, J., Kang, H., Kaiser, C. A., and Park, H. H. (2018) Molecular basis of maintaining an oxidizing environment under anaerobiosis by soluble fumarate reductase, Nat. Commun., 9, 4867, doi: 10.1038/s41467-018-07285-9.

29. Agarwal, R., Bonanno, J. B., Burley, S. K., and Swaminathan, S. (2006) Structure determination of an FMN reductase from Pseudomonas aeruginosa PA01 using sulfur anomalous signal, Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr., 62, 383-391, doi: 10.1107/S0907444906001600.

30. Borshchevskiy, V., Round, E., Bertsova, Y., Polovinkin, V., Gushchin, I., Ishchenko, A., Kovalev, K., Mishin, A., Kachalova, G., Popov, A., Bogachev, A., and Gordeliy, V. (2015) Structural and functional investigation of flavin binding center of the NqrC subunit of sodium-translocating NADH:quinone oxidoreductase from Vibrio harveyi, PLoS One, 10, e0118548, doi: 10.1371/journal.pone.0118548.

31. Venskutonytė, R., Koh, A., Stenström, O., Khan, M. T., Lundqvist, A., Akke, M., Bäckhed, F., and Lindkvist-Petersson, K. (2021) Structural characterization of the microbial enzyme urocanate reductase mediating imidazole propionate production, Nat. Commun., 12, 1347, doi: 10.1038/s41467-021-21548-y.

32. Coustou, V., Besteiro, S., Rivière, L., Biran, M., Biteau, N., Franconi, J. M., Boshart, M., Baltz, T., and Bringaud, F. (2005) A mitochondrial NADH-dependent fumarate reductase involved in the production of succinate excreted by procyclic Trypanosoma brucei, J. Biol. Chem., 280, 16559-16570, doi: 10.1074/jbc.M500343200.

33. Wargnies, M., Plazolles, N., Schenk, R., Villafraz, O., Dupuy, J.W., Biran, M., Bachmaier, S., Baudouin, H., Clayton, C., Boshart, M., and Bringaud, F. (2021) Metabolic selection of a homologous recombination-mediated gene loss protects Trypanosoma brucei from ROS production by glycosomal fumarate reductase, J. Biol. Chem., 296, 100548, doi: 10.1016/j.jbc.2021.100548.

34. Page, C. C., Moser, C. C., Chen, X., and Dutton, P. L. (1999) Natural engineering principles of electron tunnelling in biological oxidation-reduction, Nature, 402, 47-52, doi: 10.1038/46972.

35. Sogin, E. M., Michellod, D., Gruber-Vodicka, H. R., Bourceau, P., Geier, B., Meier, D. V., Seidel, M., Ahmerkamp, S., Schorn, S., D’Angelo, G., Procaccini, G., Dubilier, N., and Liebeke, M. (2022) Sugars dominate the seagrass rhizosphere, Nat. Ecol. Evol., 6, 866-877, doi: 10.1038/s41559-022-01740-z.

36. Bertsch, J., Parthasarathy, A., Buckel, W., and Müller, V. (2013) An electron-bifurcating caffeyl-CoA reductase, J. Biol. Chem., 288, 11304-11311, doi: 10.1074/jbc.M112.444919.

37. Martone, P. T., Estevez, J. M., Lu, F., Ruel, K., Denny, M. W., Somerville, C., and Ralph, J. (2009) Discovery of lignin in seaweed reveals convergent evolution of cell-wall architecture, Curr. Biol., 19, 169-175, doi: 10.1016/j.cub.2008.12.031.

38. Fernando, I. P., Kim, M., Son, K. T., Jeong, Y., and Jeon, Y. J. (2016) Antioxidant activity of marine algal polyphenolic compounds: a mechanistic approach, J. Med. Food, 19, 615-628, doi: 10.1089/jmf.2016.3706.

39. Rameshkumar, N., and Nair, S. (2009) Isolation and molecular characterization of genetically diverse antagonistic, diazotrophic red-pigmented vibrios from different mangrove rhizospheres, FEMS Microbiol. Ecol., 67, 455-467, doi: 10.1111/j.1574-6941.2008.00638.x.

40. Smith, E. A., and Macfarlane, G. T. (1996) Enumeration of human colonic bacteria producing phenolic and indolic compounds: effects of pH, carbohydrate availability and retention time on dissimilatory aromatic amino acid metabolism, J. Appl. Bacteriol., 81, 288-302, doi: 10.1111/j.1365-2672.1996.tb04331.x.

41. Knaus, T., Toogood, H. S., and Scrutton, N. S. (2016) Ene-Reductases and Their Applications. Green Biocatalysis, John Wiley and Sons, Inc., pp. 473-488.

42. Sievers, F., and Higgins, D. G. (2018) Clustal Omega for making accurate alignments of many protein sequences, Protein Sci., 27, 135-145, doi: 10.1002/pro.3290.