БИОХИМИЯ, 2022, том 87, вып. 12, с. 2065–2077

УДК 57.013

Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ лактоферрина человека в молоке с использованием однодоменных антител

© 2022 Л.И. Мухаметова 1*liliya106@mail.ru, С.А. Еремин 1, Д.А. Арутюнян 1, О.С. Горяйнова 2, Т.И. Иванова 2, С.В. Тиллиб 2*tillib@genebiology.ru

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, химический факультет, 119234 Москва, Россия

Институт биологии гена РАН, 119334 Москва, Россия

Поступила в редакцию 24.06.2022
После доработки 27.10.2022
Принята к публикации 27.10.2022

DOI: 10.31857/S0320972522120211

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: однодоменное антитело, нанотело, лактоферрин, поляризация флуоресценции, иммуноанализ.

Статья на английском языке опубликована в режиме Open Access (открытого доступа) на сайте издательства Springer. DOI: 10.1134/S0006297922120227.

Аннотация

Благодаря уникальной структуре и свойствам лактоферрин в молоке человека (hLF) обладает множеством необходимых для младенцев питательных и укрепляющих здоровье функций, например, обеспечивает защиту от бактериальных инфекций и воспаления. Недостаток лактоферрина в женском молоке или в молочных смесях может приводить к нежелательному ослаблению иммунитета детей. Определение уровня hLF необходимо для контроля качества молока с целью возможной терапевтической коррекции. Перспективным методом количественного определения и контроля концентрации hLF в молоке и молочных продуктах может стать неконкурентный формат поляризационного флуоресцентного иммуноанализа (FPIA), не требующий обязательного разделения связанных и свободных форм белков и длительной пробоподготовки образцов. Применение в качестве распознающих реагентов флуоресцентно меченных однодоменных антител верблюда («нанотел») позволяет количественно определять молекулы (антигены) относительно большего размера, в частности лактоферрин человека, методом FPIA. В данной работе использованы конъюгаты с флуоресцеин изотиоцианнатом (FITC) двух ранее полученных однодоменных антител anti‑hLf5 и anti‑hLf16, специфически узнающих различные эпитопы лактоферрина человека, но не узнающих лактоферрин козы. Изучена кинетика взаимодействия FITC-меченных нанотел с hLF. Определены в растворе константы диссоциации (KD) для антител FITC‑anti‑Lf5 и FITC‑anti‑Lf16 с hLF, которые составили 3,2 ± 0,3 нМ и 4,9 ± 0,4 нМ соответственно, что свидетельствует об их высокоаффинном связывании с лактоферрином человека. Разработан протокол FPIA, подобраны концентрации FITC‑anti‑hLf5 и FITC‑anti‑hLf16, которые дают оптимальный флуоресцентный сигнал и стабильное значение поляризации. Получена зависимость поляризации флуоресценции от концентрации hLF для неконкурентного FPIA c антителами FITC‑anti‑hLf5 и определены аналитические характеристики: предел обнаружения 2,1 ± 0,2 мкг/мл и линейный диапазон для определения концентраций – 3–10 мкг/мл. Метод FPIA обычно применяется для определения низкомолекулярных веществ. Однако в данной работе продемонстрирована принципиальная возможность распространения этого метода и для определения высокомолекулярных белков (лактоферрина человека) в биологической жидкости (молоке), если использовать в качестве распознающего реагента флуоресцентно меченные малые однодоменные антитела.

Сноски

* Адресат для корреспонденции.

Финансирование

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 20-14-00305).

Благодарности

Мы выражаем благодарность Садчиковой Е.Р. (Институт биологии гена РАН, Москва) за предоставление для данной работы очищенного лактоферрина человека и образцов женского молока.

Вклад авторов

Еремин С.А., Тиллиб С.В., Мухаметова Л.И. – концепция и руководство работой; Мухаметова Л.И., Арутюнян Д.А. – проведение FPIA-экспериментов; Горяйнова О.С., Иванова Т.И., Тиллиб С.В. – наработка и мечение нанотел; Еремин С.А., Тиллиб С.В., Мухаметова Л.И. – обсуждение результатов исследования; Мухаметова Л.И. – написание текста; Еремин С.А., Тиллиб С.В. – редактирование текста статьи.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм

Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.

Список литературы

1. González-Chávez, S. A., Arévalo-Gallegos, S., and Rascón-Cruz, Q. (2009) Lactoferrin: Structure, function and applications, Int J. Antimicrob. Agents, 33, 301.e1-301.e8, doi: 10.1016/j.ijantimicag.2008.07.020.

2. Karav, S., German, J. B., Rouquié, C., Le Parc, A., and Barile, D. (2017) Studying lactoferrin N-glycosylation, Int. J. Mol. Sci., 18, 870, doi: 10.3390/ijms18040870.

3. Rosa, L., Cutone, A., Lepanto, M. S., Paesano, R., and Valenti, P. (2017) Lactoferrin: a natural glycoprotein involved in iron and inflammatory homeostasis, J. Mol. Sci., 18, 1985, doi: 10.3390/ijms18091985.

4. Adlerova, L., Bartoskova, A., and Faldyna, M. (2008) Lactoferrin: a review, Vet. Med., 53, 457-468, doi: 10.17221/1978-VETMED.

5. Murphy, M. E., Kariwa, H., Mizutani, T., Tanabe, H., Yoshimatsu, K., Arikawa, J., and Takashima, I. (2001) Characterization of in vitro and in vivo antiviral activity of lactoferrin and ribavirin upon hantavirus, J. Vet. Med. Sci., 63, 637-645, doi: 10.1292/jvms.63.637.

6. Legrand, D., and Mazurier, J. (2010) A critical review of the roles of host lactoferrin in immunity, Biometals, 23, 365-376, doi: 10.1007/s10534-010-9297-1.

7. Baker, E. N. (2004) Lactoferrin and iron: structural and dynamic aspects of binding and release, BioMetals, 17, 209-216, doi: 10.1023/B:BIOM.0000027694.

8. Nagasako, Y., Saito, H., Tamura, Y., Shimamura, S., and Tomita, M. (1993) Iron-binding properties of bovine lactoferrin in iron-rich solution, J. Dairy Sci., 76, 1876-1881, doi: 10.3168/jds.S0022-0302(93)77520-7.

9. Fox, P. F., Uniacke-Lowe, T., McSweeney, P., and O’Mahony, J. (2015) Biologically Active Compounds in Milk, in: Dairy Chemistry and Biochemistry, Springer. Cham, doi: 10.1007/978-3-319-14892-2_11.

10. Садчиков П. Е., Гольдман И. Л., Намазова-Баранова Л. С., Яцык Г. В., Боровик Т. Э., Черноусов А. Д., Романченко А. И., Садчикова Е. Р., Лукоянова О. Л., Звонкова Н. Г., Беляева И. А. (2016) Лактоферрин в проблеме противоинфекционной защиты детей первого года жизни, Педиатрическая фармакология, 13, 607-613, doi: 10.15690/pf.v13i6.1677.

11. Chen, P.-W., and Mao, F.C. (2004) Detection of lactoferrin in bovine and goat milk by enzyme-linked immunosorbent assay, J. Food Drug Anal., 12, doi: 10.38212/2224-6614.2653.

12. Tomassetti, M., Martini, E., Campanella, L., Favero, G., Sanzò, G., and Mazzei, F. (2013) Lactoferrin determination using flow or batch immunosensor surface plasmon resonance: Comparison with amperometric and screen-printed immunosensor methods, Sens. Actuat. B Chem., 179, 215-225, doi: 10.1016/j.snb.2012.09.096.

13. Chen, H., Wang, Z., Fan, F., Shi, P., Xu, X., Du, M., and Wang, C. (2021) Analysis method of lactoferrin based on uncoated capillary electrophoresis, eFood, 2, 147-153, doi: 10.2991/efood.k.210720.001.

14. Zhang, J., Lai, S., Cai, Z., Chen, Q., Huang, B., and Ren, Y. (2014) Determination of bovine lactoferrin in dairy products by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry based on tryptic signature peptides employing an isotope-labeled winged peptide as internal standard, Anal. Chim. Acta, 829, 33-39, doi: 10.1016/j.aca.2014.04.025.

15. Palmano, K. P., and Elgar, D. F. (2002) Detection and quantitation of lactoferrin in bovine whey samples by reversed-phase high-performance liquid chromatography on polystyrene-divinylbenzene, J. Chromatogr. A, 947, 307-311, doi: 10.1016/s0021-9673(01)01563-1.

16. Tsakali, E., Chatzilazarou, A., Houhoula, D., Koulouris, S., Tsaknis, J., and Van Impe, J. (2019) A rapid HPLC method for the determination of lactoferrin in milk of various species, J. Dairy Res., 86, 238-241, doi: 10.1017/s0022029919000189.

17. Nithipatikom, K., and McGown, L. B. (1987) Homogeneous immunochemical technique for determination of human lactoferrin using excitation transfer and phase-resolved fluorometry, Anal. Chem., 59, 423-427, doi: 10.1021/ac00130a010.

18. Chen, M. X., Wen, F., Zhang, Y. D., Li, P., Zheng, N., and Wang, J. Q. (2019) Determination of native lactoferrin in milk by HPLC on HiTrap Heparin HP column, Food Anal. Method., 12, 2518-2526, doi: 10.1007/s12161-019-01572-x.

19. Wang, N., Jiang, X., Xu, X., Liu, Y., Liu, L., Lu, A., Lu, J., and Luan, Y. (2021) An aptamer affinity column for purification and enrichment of lactoferrin in milk, J. Chromatography B, 1178, 122724, doi: 10.1016/j.jchromb.2021.122724.

20. Hendrickson, O. D., Taranova, N. A., Zherdev, A.V., Dzantiev, B. B., and Eremin, S. A. (2020) Fluorescence polarization-based bioassays: new horizons, Sensors, 20, 7132, doi: 10.3390/s20247132.

21. Zhang, H., Yang, S., De Ruyck, K., Beloglazova, N., Eremin, S. A., De Saeger, S., Zhang, S., Shen, Ji., and Wang, Z. (2019) Fluorescence polarization assays for chemical contaminants in food and environmental analyses, Trends Anal. Chem., 114, 293-313, doi: 10.1016/j.trac.2019.03.013.

22. Nishiyama, K., Fukuyama, M., Maeki, M., Ishida, A., Tani, H., Hibara, A., Tokeshi, M. (2021) One-step non-competitive fluorescence polarization immunoassay based on a Fab fragment for C-reactive protein quantification, Sensors Actuators B Chem., 326, 128160, doi: 10.1016/j.snb.2020.128982.

23. Nishiyama, K., Takeda, Y., Takahash, K., Fukuyama, M., Maeki, M., Ishida, A., Tani, H., Shigemura, K., Hibara, A., Ogawa, H., and Tokeshi, M. (2021) Non-competitive fluorescence polarization immunoassay for detection of H5 avian influenza virus using a portable analyzer, Anal. Bioanal. Chem., 413, 4619-4623, doi: 10.1007/s00216-021-03193-y.

24. Nishiyama, K., Takahashi, K., Fukuyama, M., Kasuya, M., Imai, A., Usukura, T., Maishi, N., Maeki, M., Ishida, A., Tani, H., Hida, K., Shigemura, K., Hibara, A., and Tokeshi, M. (2021) Facile and rapid detection of SARS-CoV-2 antibody based on a noncompetitive fluorescence polarization immunoassay in human serum samples, Biosens. Bioelectron., 190, 113414, doi: 10.1016/j.bios.2021.113414.

25. Takeda, Y., Yonezawa, Y., Asake, S., Ogawa, H., and Imai, K. (2020) A fluorescence polarization immunoassay for the rapid detection of antibody against influenza A virus in chicken and goat sera, J. Vet. Diagn. Invest., 32, 887-891, doi: 10.1177/1040638720960046.

26. Hamers-Casterman, C., Atarhouch, T., Muyldermans, S., Robinson, G., Hamers, C., Songa, E.B, Bendahman, N., and Hamers, R. (1993) Naturally occurring antibodies devoid of light chains, Nature, 363, 446-448, doi: 10.1038/363446a0.

27. Flajnik, M. F., and Kasahara, M. (2010) Origin and evolution of the adaptive immune system: genetic events and selective pressures, Nat. Rev. Genet., 11, 47-59, doi: 10.1038/nrg2703.

28. Тиллиб, С. В., Иванова, Т. И., Васильев Л. А. (2010) Фингерпринтный анализ селекции наноантител методом фагового дисплея с использованием двух вариантов фагов-помощников, Acta Naturae, 2, 100-108.

29. Tillib, S. V., Privezentseva, M. E., Ivanova, T. I., Vasilev L. F., Efimov, G. A., Gurskiy, Ya. G., Georgiev, G. P., Goldman, I. L., and Sadchikova, E. R. (2014) Single-domain antibody-based ligands for immunoaffinity separation of recombinant human lactoferrin from the goat lactoferrin of transgenic goat milk, J. Chromatogr. B, 949-950, 48-57, doi: 10.1016/j.jchromb.2013.12.034.

30. Горяйнова О. С., Иванова Т. И., Рутовская М. В., Тиллиб С. В. (2017) Метод параллельного и последовательного генерирования однодоменных антител для протеомного анализа плазмы крови человека, Мол. биол., 51, 985-996.

31. Тиллиб С. В. (2020) Перспективы использования однодоменных антител в биомедицине, Мол. биол., 54, 362-373, doi: 10.31857/S0026898420030167.

32. Schreiber, A. B., and Yfimovich, J. (1983) Quantitative fluorometric assay for detection and characterization of Fc receptors, Meth. Enzymol., 93, 147-155, doi: 10.1016/s0076-6879(83)93039-2.

33. Pace, C. N, Vajdos, F., Fee, L., Grimsley, G., and Gray, T. (1995) How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein, Protein Sci., 11, 2411-23, doi: 10.1002/pro.5560041120.

34. Chung, T., and Raymond, K. (1993) Lactoferrin: the role of conformational changes in its iron binding and release, J. Am. Chem. Soc., 115, 6765-6768, doi: 10.1021/ja00068a037.

35. Мухаметова Л. И., Крылов В. Б., Соловьев A. C., Яшунский Д. В., Матвеев A. Л., Тикунова Н. В., Еремин С. А., Нифантьев Н. Э. (2021) Характеристика аффинности анти-β-(1→3)-d-глюканового моноклонального антитела 3G11 методом поляризационно-флуоресцентного иммуноанализа, Известия Академии наук. Сер. хим., 5, 975-980.

36. Nevinskii, A. G., Soboleva, S. E., Tuzikov, F. V., Buneva, V. N., and Nevinsky, G. A. (2009) DNA, oligosaccharides, and mononucleotides stimulate oligomerization of human lactoferrin, J. Mol. Recognit., 22, 330-342, doi: 10.1002/jmr.952.

37. Zhang, S., Chen, L., Kumar, S., Wu, L., Lawrence, D. S., and Zhang, Z.-Y. (2007) An affinity-based fluorescence polarization assay for protein tyrosine phosphatases, Methods, 42, 261-267, doi: 10.1016/j.ymeth.2007.02.008.