Конформационная стабильность цитохрома b₅, зеленого флуоресцирующего белка (EGFP) и химерного белка Hmwb₅-EGFP^*

Аннотация

Приведены результаты исследования конформационной стабильности белков (полноразмерного цитохрома b₅ (Hwmb₅), зеленого флуоресцирующего белка (EGFP) и сшитого в единую полипептидную цепь химерного белка Hwmb₅-EGFP) в растворах гуанидингидрохлорида. Для мониторинга разворачивания белковой глобулы использованы следующие критерии: интенсивность триптофановой флуоресценции, интенсивность флуоресценции GFP в видимой области, поглощение гема цитохрома b₅ и хромофора GFP, анизотропия флуоресценции. С использованием различных подходов определены термодинамические параметры разворачивания белковой глобулы. Для анализа данных использованы двустадийная модель и метод линейной экстраполяции. Разворачивание белковых молекул дополнительно контролировалось измерением констант Штерна–Фольмера для тушения триптофановой флуоресценции белков акриламидом, ионами цезия и йода. Обнаружено, что доступность остатков триптофана обоих компонентов в составе сшитого белка частицам тушителя флуоресценции снижена по сравнению с исходными молекулами. Показано, что термодинамическая стабильность белковых глобул в составе химерного белка ниже, чем у индивидуальных белков в растворе, причем разница в свободной энергии разворачивания более значительна для цитохрома b₅ (29 ± 4 и 13 ± 2 кДж/моль), чем для EGFP (26 ± 0,9 и 20 ± 2,7 кДж/моль). Полученные данные свидетельствуют о том, что объединение белков в полипептидную цепь с помощью генно-инженерных методов может значительно сказываться на стабильности конструируемых структур, а в случае цитохрома b₅ и EGFP приводит к снижению свободной энергии перехода из нативной формы в развернутую и, следовательно, к снижению термодинамической стабильности белковых глобул по сравнению с изолированными белками.

Текст статьи

Пожалуйста, введите код, чтобы получить PDF файл с полным текстом статьи: