БИОХИМИЯ, 2009, том 74, вып. 2, с. 172–180
УДК 577.218
Молекулярное клонирование и экспрессия в Escherichia coli активной оксидазы D-аминокислот из Zea mays L*
1 Research Institute for Fundamental Sciences (RIFS), University of Tabriz
2 Department of Plant Breeding and Biotechnology, University of Tabriz
Поступила в редакцию 23.04.2008
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: оксидаза D-аминокислот, D-аминокислоты, Zea mays, флавоэнзим, сверхэкспрессия.
Аннотация
Оксидаза D-аминокислот (DAAO) является FAD-зависимым ферментом метаболизма D-аминокислот у животных и микроорганизмов. Однако в растительной системе подобная активность не обнаружена до сих пор. Предсказана полная кодирующая последовательность DAAO, состоящая из 1158 пар оснований и кодирующая белок длиной в 386 аминокислотных остатков. Была выделена и клонирована кДНК из листьев растений кукурузы, которые могут использовать D-аланин в качестве источника азота и нормально расти на среде, содержащей D-аланин в концентрациях от 0,01 до 0,1%. Выделенная кДНК была встроена в экспрессионный вектор pMALc2X для E. coli ниже последовательности, кодирующей мальтозосвязывающий белок. Вектором pMALc2X-DAAO трансформировали клетки штамма TB1 E. coli. Химерную DAAO (с молекулярной массой около 78 кДа) экспрессировали в клетках, выращенных в нормальных условиях, до концентрации 5 мг на 1 л культуры клеток. Экспрессированный продукт очищали афинной хроматографией и подвергали тесту на DAAO активность in vitro в присутствии пяти различных D-аминокислот. Рекомбинантный белок катализировал окисление D-аланина и D-аспартата, но не окислял D-лейцин, D-изолейцин и D-серин. Последовательность кДНК, представленная в этой публикации, была аннотирована в базе данных EMBL с кодом доступа AM407717.
Текст статьи
Сноски
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM08-148, 09.11.2008.
** Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.