Взаимодействие AРЕ1 и других репарационных белков с ДНК-дуплексами, имитирующими интермедиаты репарации и репликации ДНК^*

Аннотация

Исследовано взаимодействие АРЕ1 и β-полимеразы с ДНК-структурами, имитирующими интермедиаты репарации и репликации ДНК, с помощью методов фотоаффинной модификации и задержки в геле. Проведена фотоаффинная модификация АРЕ1 и β-полимеразы ДНК-субстратами, содержащими 3′-концевую фотоактивируемую группировку, для очищенных белков или в клеточном экстракте эмбриональных фибробластов мыши (MEF). В целом для белков MEF-экстракта и очищенных АРЕ1 и β-полимеразы обнаружена одинаковая зависимость эффективности образования ковалентных сшивок белок–ДНК от природы группы на 5′-конце разрыва/бреши ДНК-субстрата. Использованы различные типы ДНК-дуплексов, которые частично можно рассматривать как интермедиаты короткозаплаточного (ДНК с фосфатной группой в бреши/разрыве) или длиннозаплаточного (ДНК, содержащая на 5′-конце свисающий сахарофосфат или последовательность из нескольких нуклеотидов – флэп) путей эксцизионной репарации оснований (ЭРО) ДНК. Отмечено, что другие ДНК-дуплексы (частичный дуплекс с утопленным 3′-концом и ДНК с гидроксильной группой в бреши/разрыве) не относятся к структурам, возникающим в процессе ЭРО. С помощью данных, полученных двумя методами, установлено, что АРЕ1 наиболее эффективно связывается с ДНК-субстратом, содержащим 5′-сахарофосфатную группу в бреши/разрыве, а β-полимераза – с ДНК-дуплексом с однонуклеотидной брешью, фланкируемой 5′-p-группой. Отмечено, что при одновременном присутствии АРЕ1 и β-полимеразы образуется тройной комплекс АРЕ1–β-полимераза–ДНК, который наиболее эффективно формируется с ДНК-продуктом эндонуклеазной реакции, катализируемой АРЕ1, а также с ДНК, содержащей 5′-флэп, или ДНК с однонуклеотидной брешью с 5′-p-группой. Показано, что АРЕ1 стимулируется синтез ДНК, катализируемый β-полимеразой, а белок, входящий в группу комплементации, обусловливающую чувствительность клеток к рентгеновскому излучению, стимулирует 3’–5′-экзонуклеазную активность АРЕ1 на частичном ДНК-дуплексе с утопленным 3′-концом.

Текст статьи

Пожалуйста, введите код, чтобы получить PDF файл с полным текстом статьи: